聚乙二醇-b-聚己内酯/聚己内酯单分散电喷微球的制备与亲水性研究

杨 雪 邵华英 张琼月 吴小红

(重庆医科大学附属口腔医院, 口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室， 重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆 401147)

引言

缓释微球是指药物溶解或分散在高分子材料基质中形成的微小球状实体。关于微球制剂用于治疗口腔常见疾病的研究在近10年得到飞速的发展[1-2]。近年来，用静电纺丝的方法制备微球(即电喷微球)得到迅速发展，比传统制备微球有明显的优势：设备常规性，成本低，步骤相对简单，产生的微球单分散性即粒径一致性佳[3]。高分子载药微球作为药物控释载体材料、吸附剂、表面修饰剂，在包裹亲水性药物时，需对疏水的高分子聚合物进行亲水性修饰，更利于细胞黏附[4-5]。

然而，制备单分散性良好、亲水性佳的电喷微球，需要研究不同溶液体系下的电喷参数(如电压、流速以及聚合物和药物的种类及浓度)对电喷模式的影响，稳定的泰勒锥模式才能形成单分散性良好的微球[3]。聚己内酯PCL是一种被FDA批准的可生物降解的聚酯材料，其最大的优点是降解时间长，可作为长期载药的组织支架在组织工程中得到应用[6]；同时，PCL对小分子药物相溶性好，且相比PLGA等高分子材料所降解产生的酸性环境强度弱[7]。PCL制备的微球单分散性更强[8]，也是常用于制备电喷微球的聚合物。由于其极强的疏水性，在包裹亲水性药物时，为了减小突释，通常要对其进行改性，对进一步提高其包封率、延长药物缓释时间很关键[9]。双亲类物质一般用于修饰疏水性的PCL，用作对亲水性药物的包裹[10]，双亲材料PEG-b-PCL可用于修饰PCL[11]，性能稳定并具有较好的生物相容性[12]，但目前没有关于PEG-b-PCL/PCL制备电喷微球的研究。笔者拟用PEG-b-PCL改善PCL亲水性，并研究电喷微球随不同PEG-b-PCL含量(以下简称双亲含量)的形态大小、粒径分布以及亲水程度的变化，同时讨论能制备出单分散性良好的微球所需要的流速和电压参数，旨在为进一步制备载药微球打下实践基础。

1 材料和方法

1.1 材料

静电纺丝仪(北京永康乐业科技发展有限公司)，扫描电子显微镜(Jeol，Japan)，偏光显微镜(Nikon，Japan)，常温磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)，接触角测量仪(北京环球恒达科技有限公司)，激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP8 CARS, Germany)，图像分析软件ImageJ-win64(NIH，USA)。

聚己内酯(Mw=80 000, Sigma)，聚乙二醇-b-聚己内酯(聚乙二醇Mw=2 000，聚己内酯Mw=2 000，山东岱罡生物有限公司)，氯仿(分析纯，山东化工)，超纯水。

1.2 方法

1.2.1微球的制备

根据不同双亲含量比例(以PCL的重量为参照)进行4% PCL(W/V)溶液配制(见表1)，配好的溶液在室温下充分搅动2 h后加入装有21号不锈钢钝性针头的5 mL注射器(温度23～25 ℃，湿度40%～45% RH)，针头与高压直流电源的正极相连，电压设置变量值为8、10和12 kV，流速设置变量值为0.5、1.0、1.5 mL/h。在与针头相距20 cm的接收滚筒上接负极，滚筒上覆盖着铝箔纸，作为微球的接收器，用于微球收集和电镜观察，而盖玻片接收用来偏光显微镜观察。电喷结束后，接收器置于通风橱中过夜，让残留的有机溶剂挥发，收集到的微球转移至小玻璃瓶中储存。

1.2.2微球的形态和大小

收集到微球的铝箔纸剪成1 cm×1 cm，固定在样品台上，旋转蒸镀仪喷金，使用扫描电镜(scanning electron microscope SEM)进行观察，电子加速度为20 kV；载玻片收集到的微球在偏振光显微镜下观察，用imagej软件测量微球直径并计数(>100个/样本)，结果以均值±标准差表示；微球直径的单分散性即粒径分布一致性，用变异系数CV(%)表示，值越低表明微球单分散性即粒径分布一致性越佳。

CV=标准差/均值 (%)

(1)

表1不同双亲含量的电喷溶液

Tab.1Electrosprayingsolutionswithdifferentamphiphilic

content

含量/%01020电喷溶液S1S2S3

1.2.3接触角测试

用铝箔纸收集到的微球直接进行接触角仪器检测，每组3个样本，每个样本重复测量3次，结果以均值±标准差表示，并采用SPSS 22统计软件进行单因素方差分析。

1.2.4微球在水中的分散性

双亲含量为0%、10%、20%的微球分别称取4 mg，分别加入含有4 mL的EP管，涡旋混匀后形成1 mg/mL的微球混悬液，分别取微球混悬液滴于盖玻片上，采用激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)观察微球在水中分散性。

2 结果

2.1 不同双亲含量微球的形态大小

2.1.1不同双亲含量微球的形态

如图1所示，未加入双亲时，微球表面粗糙(见图1(a)；加入10%～20%双亲后，微球表面相对光滑(见图1(b)、(c)；继续加入双亲30%后，光镜图(见图1(d))可清晰地看见微球之间由纤维连接，没有形成理想的微球形态，因此没有进行扫描电镜的进一步观察。

图1 不同双亲含量微球(电喷参数：流速1 mL/h，电压10 kV)((a)～(c)左为光镜图，500×；中和右为扫描电镜图，分别为500×和2000×)的光镜图和扫描电镜图。(a)PCL；(b)PCL/10%双亲；(c)PCL/20%双亲；(d)PCL/30%双亲(光镜图，500×)Fig.1 Optical microscopic and SEM pictures of microspheres with different amphiphilic content (electrospraying parameters: flow rate 1 mL/h, voltage 10 kV) ((a)-(c), left side are optical microscopic pictures, 500 times; middle and right side are SEM pictures, respectively 500 times and 2000 times). (a)PCL; (b)PCL/10% amphiphilic content; (c) PCL/20% amphiphilic content; (d)PCL/30% amphiphilic content (optical microscopic pictures, 500 times)

2.1.2不同双亲含量微球的大小

如图2和表2所示，未加入双亲时，微球直径为(18.08±5.52)μm；加入10%～20%双亲后，直径由(6.25±0.94)μm降至(5.52±1.14)μm，微球粒径分布一致性较好，直径变异系数值为15%～21%；继续加入双亲30%后，微球直径分布较广，变异系数值为38%，单分散性较差。

图2 不同双亲含量微球的直径分布直方图。(a)PCL；(b) PCL/10%双亲；(c)PCL/20%双亲；(d)PCL/30%双亲Fig.2 Distribution histographs about the diameters of microspheres with different amphiphilic content(n=100). (a) PCL; (b)PCL/10% amphiphilic content; (c)PCL/20% amphiphilic content; (d)PCL/30% amphiphilic content

表2不同双亲含量的微球直径大小、形态及变异系数(n=100)

Tab.2Size,morphologyandsizedistributionofmicrosphereswithdifferentamphiphiliccontent(n=100)

微球直径/μm形状变异系数CV/%PCL18.08±5.52球形31PCL/10%双亲6.25±0.94球形15PCL/20%双亲5.52±1.14球形21PCL/30%双亲4.46±1.68球形+纤维38

2.2 不同流速和电压微球的形态大小

2.2.1不同流速和电压微球的形态

当流速固定在0.5 mL/h、电压为8和12 kV时，微球直径由丝状物质连接，在电压为12 kV时较明显(见图3(a)、(c))。但当流速增至1.5 mL/h时，成球性相对较好，均未见丝状纤维(见图3(b)、(d))。而当流速为1 mL/h、电压为10 kV时，微球成球性较好(见图1(b)、(e))。

2.2.2不同流速和电压微球的大小

随着流速增加,微球直径也相应增加，并且微球直径与流速的平方根呈线性关系(见图4(a))。未加入双亲材料时，微球直径的变化较明显(从14.4 μm到23.6 μm)，但加入10%和20%双亲后，变化范围较窄(从4.75 μm到7.3 μm)，然而，加入双亲后，微球直径的变异系数变低，单分散性提高。当流速1 mL/h时，变异系数CV值最低为15%(见图4(c))。

随着电压从8 kV增加到12 kV，微球直径呈减小趋势，加入双亲后的直径变化不明显(见图4(b))， 电压10 kV时变异系数CV值最低为15%，单分散性相对较佳(见图4(d))。

2.3 不同双亲含量的微球亲水性

未加入双亲时，PCL微球接触角为126.2°±4.8°；加入10%双亲，接触角约83.24°±5.65°；加入20%双亲，接触角约29.9°±4.9°(见表3)。如图5所示，加入双亲后，微球接触角减小，3组差别具有统计学意义(P<0.05)。

2.4 不同双亲含量的微球在水中的分散性

如图6所示，将微球加入水后，不含双亲的微球并未均匀混合于水中，可见到微球于水面聚集，激光共聚焦显微镜下微球混悬液也呈现团聚的现象；而加入双亲10%、20%后的微球能形成均匀的混悬液，激光共聚焦显微镜显示微球在水中分散性较好。

表3 不同双亲含量的微球接触角大小(n=3)

图3 双亲含量为10%时不同电压及流速参数下电喷微球的光镜图(500×)。(a)8 kV, 0.5 mL/h; (b)8 kV, 1.5 mL/h; (c)12 kV, 0.5 mL/h; (d)12 kV, 1.5 mL/h; (e)10 kV, 1 mL/hFig.3 Optical microscopic pictures of the electrosprayed microspheres with the amphiphilic content fixed at 10% under different parameters of voltage and flow rate (500×). (a)8 kV, 0.5 mL/h; (b)8 kV, 1.5 mL/h; (c) 12 kV, 0.5 mL/h; (d)12 kV, 1.5 mL/h; (e)10 kV, 1 mL/h

图4 在电压一定或者溶液流速一定的条件下，3种溶液电喷微球的平均直径及粒径分布。(a)电压为10 kV时，微球直径随流速的变化；(b)流速为1 mL/h时，微球直径随电压的变化；(c) 电压为10 kV时，微球直径的粒径分布随流速的变化；(d) 流速为1 mL/h时，微球直径的粒径分布随电压的变化Fig.4 Mean diameter and particle size distribution of electrosprayed microspheres of three solutions under certain voltage or flow rate. (a)When the voltage was 10 kV, the size of microspheres varied with flow rate; (b)When the flow rate was 1 mL/h, the size of microspheres varied with voltage. (c) When the voltage was 10 kV, the diameter distribution of the microspheres varied with the flow rate; (d)When the flow rate was 1 mL/h, the diameter distribution of the microspheres varied with voltage

图5 不同双亲含量的微球接触角。(a)PCL；(b)PCL/10%双亲；(c)PCL/20%双亲Fig.5 Contact angle of microspheres with different amphiphilic content. (a)PCL; (b)PCL/10% amphiphilic content; (c) PCL/20% amphiphilic content

图6 不同双亲含量的微球悬浮液(每行左为微球悬浮液的宏观图，右为微球悬浮液的激光共聚焦显微镜图，400×)。(a)PCL；(b)PCL/10%双亲；(c)PCL/20%双亲Fig.6 Images of microsphere suspensions with different amphiphilic content (The left side of each row are macrographs of microsphere suspensions; The right side of each row are CLSM images of microsphere suspensions, magnification times, 400 times). (a)PCL; (b) PCL/10% amphiphilic content; (c)PCL/20% amphiphilic content

3 讨论

3.1 微球表面形态的影响因素

电喷微球的形成主要由两个机制控制:溶剂挥发的同时，聚合物高分子链缠绕扩散，固化成微球。充分的溶剂挥发和足够的聚合物扩散，才能形成单分散性、球形的微球。与微球表面特性相关的有两个指数Pe[3]和φRay[13]，有

(2)

(3)

式(3)中，φray指聚合物体积分数，Q指流速，I指电流，γ指溶液表面张力，体现了电压、流速对微球形态的影响。φray指聚合物高分子链缠绕的聚合物体积分数：当其足够大时，液滴很难从稳定的结构中逸出产生二级粒子；当其较小时，二级粒子飞逸出被延伸成较细的纤维[15]。

因此，充分的溶剂挥发和聚合物扩散对微球表面形态至关重要。氯仿沸点为61.2°，由图(1(a))可见，微球表面轻度粗糙；由式(2)可见，当加入双亲物质10%～20%后，微球表面相对光滑，这可能是因为电喷溶液黏弹性降低，聚合物扩散相对加快，在溶剂挥发的过程中，聚合物能得到相对较好的扩散，形成的微球表面相对光滑(见图1(b)，1(c))。而继续加入30%双亲后，微球之间由较多纤维连接，这可能是因为微球表面张力减小明显，φray值减小，容易产生纤维(见图1(d))。

微球形成过程中，溶剂挥发彻底对形成单分散性良好的微球至关重要，影响溶剂挥发的因素除了溶剂种类还有环境中湿度、温度及接收距离等[3,16]。从图(1(a)～(c))中可看到微球之间有明显的粘连，这可能是由于有机溶剂不能彻底挥发所致[17-18]，微球在接收板上未完全固化，残余的溶剂使得微球表面由于分子链缠绕而发生溶蚀作用，出现了微球的粘连。

当微球流速固定在0.5 mL/h、电压为8和12 kV时，微球直径由丝状纤维连接，在电压为12 kV时较明显(见图3(a)、(c))，这是因为电压增加，φray值减小，易生成纤维；当电压固定在12 kV、流速增至1.5 mL/h时，由于φray值增大，成球性相对较好，未见丝状纤维(见图3(b)、(d))。因此，高电压时，适当提高流速有利于微球的形成[13]。

3.2 微球直径大小的影响因素

影响微球直径大小的影响因素有很多，比如溶液导电性、流速等，直径可表示[19]为

(4)

式中，Q指流速，ρ指溶液密度，γ指溶液导电性，σ指溶液表面张力。

该实验加入双亲PEG-b-PCL，微球粒径变小(见图2)。由式(4)所示，这可能是因为所加的双亲试剂含有氢键，溶液极性增加，使得溶液导电性增强，微球粒径变小。同时，加入双亲10%～20%后，微球直径分布的变异系数变低，这说明电喷状态稳定，制备的微球单分散性较佳。

流速与微球直径的平方根呈线性关系(见图4(a))，意味着理论上微球直径可以通过流速的变化来控制，这在未加入双亲材料时微球直径的变化较明显。但加入10%和20%双亲后，变化范围较窄，这可能是因为加入双亲后，溶液导电性增加，微球直径减小，因流速而影响的直径变化不明显。加入双亲后，微球直径的变异系数CV值减小，这是因为此时溶液稳定性提高，制备的微球单分散性增强。流速1 mL /h时， CV值较低，意味着电喷状态较稳定。

随着电压增加，微球直径呈减小趋势，加入双亲后的直径变化不明显(见图4(b))，电压10 kV时单分散性相对较佳(见图4(d))。这可能是因为电压增加，电场中的液滴更容易库伦裂变产生二级粒子，从而使微球直径相应变小；电压10 kV时，CV值较低，意味着电喷状态较稳定。

3.3 微球表面的亲水性

双亲材料PEG-b-PCL是由亲水的聚乙二醇(PEG)和疏水的聚己内酯(PCL)聚合形成的两亲性嵌段共聚物， 可用于改善PCL的亲水性[9]，由图5可见，双亲含量由0%增至10%和20%时，微球的亲水性逐渐上升，微球接触角由 126.2°±4.8°降至29.9°±4.9°(见表3)。材料表面亲水性对调节细胞行为有重要的作用，经过研究表明，细胞在亲水的表面黏附以及铺展更佳[20]。

当微球放入水中时，微球在水溶液中的聚集现象与微球混悬液中的氢键、范德华力有关[21]。在该实验中，当双亲含量为10%～20%的微球放入水中时，微球聚集的现象减轻。而双亲含量为0%的微球的聚集更明显，宏观上看微球更多的是贴于水面或管壁，而非均匀混于水中。激光共聚焦显微镜下可见：未加入双亲时，微球聚集较明显(见图6(a))；加入双亲后，微球分散象较好(见图6(b)、(c))。这可能是因为当不含双亲时，微球表面疏水，在水中微球聚集成簇，疏水的微球于水液面或管壁聚集。因此，亲水性佳的微球更容易形成均匀的混悬液，进一步表明加入10%和20%双亲含量的微球亲水性佳。

4 结论

本实验以PCL/PEG-b-PCL /氯仿为体系，研究了不同双亲含量(PEG-b-PCL)、电压、流速对微球的形态大小及粒径分布的影响，并研究了不同PEG-b-PCL含量对微球的亲水程度影响。研究结果表明：电压10 kV、流速为1 mL/h、双亲含量10%～20%时，能得到单分散性良好的微球；双亲含量20%时，微球表面接触角为29.9°±4.9°，亲水性较好。该研究为进一步制备载药微球打下基础。