稀有鮈鲫鱼热休克蛋白HSP70多态性分析

2019-03-18 02:21陈小青张银依付燕王姗姗李冰刘汉伟马中春虞维娜
健康大视野 2019年4期

陈小青 张银依 付燕 王姗姗 李冰 刘汉伟 马中春 虞维娜

【摘要】目的:建立稀有鮈鲫鱼热休克蛋白HSP70提取方法,进行双向电泳技术、western blot分析,为构建稀有鮈鲫鱼的蛋白质分析提供了科学依据。方法:提取稀有鮈鲫鱼的热休克蛋白HSP70,采用双向电泳技术、western blot技术进行分析。结果:样本里面HSP 70有两种等电点,约5和7左右,且片段大小主要位于50-100之间。结论:本研究获得了非常有价值的稀有鮈鲫鱼的热休克蛋白HSP70多态性分析结果,为构建稀有鮈鲫鱼的蛋白质分析提供了科学依据。

【关键词】稀有鮈鲫;热休克蛋白;HSP70;多态性分析

【中图分类号】R181.3+2【文献标志码】A【文章编号】1005-0019(2019)04-198-02

由于在应激反应中的敏感性以及其功能的多样性,热休克蛋白已成为引人注意的药物靶点,其中HSP70是目前研究最多的热休克蛋白。特别是HSP70的高表达可以缓解细胞受到的损伤,增强机体对应激的抵抗力,同时HSP70在抗细胞凋亡、抗氧化、抗病毒及免疫等多方面起着重要的作用 [1]。稀有鮈鲫是我国境内特有的一种新的鱼类实验生物,对重金属、农药等非常敏感,是环境生态毒性试验理想试验用鱼[2]。但稀有鮈鲫鱼热休克蛋白HSP70多态性方面的研究尚未见公开报道。本研究建立了稀有鮈鲫鱼热休克蛋白HSP70多态性分析方法,为稀有鮈鲫鱼的蛋白质分析提供了科学依据。

1受试生物:

稀有鮈鲫鱼,由中国科学院水生生物研究所提供种鱼后在本实验室内繁育驯化。实验鱼体长为2.5cm~3.0cm。

2实验步骤

2.1蛋白提取及定量

2.1.1蛋白提取:将沙蒿提取物置于3kDa的超滤管中,14000g,离心20min,然后加入400μl水化液,14000g,离心20min,重复三次(充分置换沙蒿提取物中的PBS),然后将超滤管倒置于新的收集管中,5000g,离心5min,收集样本。

2.1.2蛋白浓度:测定提取的蛋白浓度,用于双向电泳。根据曲线公式计算各样品蛋白浓度。

2.2等电聚焦

2.2.1取150μg蛋白样品,用样品水化液将其充分混合,调整总体积为150μL。

2.2.2从冰箱中取出低温保存的IPG胶条(7cm,pH=3-10),在室温下放置10分钟。

2.2.3在聚焦槽中缓慢加入蛋白样品。

2.2.4去除IPG胶条的保护膜,分清胶条的正负极,将胶条胶面朝下缓慢放置在聚焦漕中。

2.2.5在每根胶条的支持膜面缓慢加上2ml覆盖油,防止等电聚焦过程中蛋白溶液的蒸发。

2.2.6准备完毕后开始等电聚焦程序。

2.3胶条平衡及SDS-PAGE电泳

2.3.1将胶条放入含10ml平衡缓冲液1的平衡管中,室温缓慢水平摇晃15min,然后再将胶条转移至含10ml平衡缓冲液2的平衡管中缓慢水平摇晃15min。

2.3.2将平衡好的胶条放到第二向SDS-PAGE凝胶的上表面,使胶条与SDS-PAGE凝胶的胶面充分接触。

2.3.3将凝胶转移至电泳槽中进行电泳,电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝膠转印。

2.4凝胶转印

2.5免疫检测

2.5.1用TBST液将封闭的膜漂洗2-3次。

2.5.2用蒸馏水将加样槽清洗干净,晾干,用一次性手套将膜覆盖好,按标记和实验设计要求切下膜条(一般为3 mm宽左右)并按顺序放入到加样槽中。加入约1ml一抗。

2.5.3室温下摇床孵育2h。

2.5.4弃去一抗,膜条仍置于加样槽中,每个槽再加2-3 ml TBST。上摇床洗涤5-10min后换液,反复4次。

2.5.5用含0.5%脱脂奶粉的TBST按1:5000稀释酶标二抗,再在每个加样槽中加入20ml左右二抗,室温下摇床孵育1h。

2.5.6弃去二抗,膜仍置于加样槽,每个槽再加2-3 ml TBST,上摇床洗涤5-10min后换液,反复4次。

2.5.7化学发光

将膜贴在玻璃纸上,加入底物,做化学发光。

2.6凝胶扫描及图像分析

胶片应用ImageScanner 扫描仪进行扫描,扫描模式为灰度模式,光密度值为300dpi。

使用PDquest 8.0 软件对图像进行分析,主要操作包括胶片蛋白点检测、图像背景扣除、蛋白点灰度值标准化、不同胶片间蛋白点匹配。

3结果

3.1蛋白浓度结果

结果显示,蛋白浓度为16.45 ug/uL。

样品编号 A060

蛋白浓度(ug/uL) 16.45

3.2全蛋白电泳分析结果

结果显示,样本中的蛋白种类丰富,且条带清晰,说明蛋白没有降解,满足后续实验要求。

3.3等电点分析结果

结果显示,样本里面HSP 70有两种等电点,约5和7左右,且片段大小主要位于50-100之间。

4讨论

HSP70被认为是最保守的蛋白,人的HSP70和细菌同源蛋白DnaK的序列同源性可达50%。HSP70家族有多个成员,有些存在于特定的细胞器中,有些在特定组织中表达,总体来说,很多亚型在细胞中的生物功能是重叠的。稀有鮈鲫热休克蛋白HSP70多态性分析方面的研究尚未见公开报道。本研究建立了稀有鮈鲫鱼热休克蛋白HSP70多态性分析方法。本研究结果显示,样本里面HSP 70有两种等电点,约5和7左右,且片段大小主要位于50-100之间。本研究获得了非常有价值的稀有鮈鲫鱼的热休克蛋白HSP70多态性分析结果,为构建稀有鮈鲫鱼的蛋白质分析提供了科学依据。

参考文献

[1]刘宗亮,张仁梅,孟庆国.以热休克蛋白HSP70为靶点的药物研究进展.中国药科大学学报. 2017(4):416-424

[2]王剑伟,曹文宣. 中国本土鱼类模式生物稀有晌鲫研究应用的历史与现状. 生态毒理学报. 2017,12(2):20-3