外泌体在肺癌发病机制及诊疗中的研究进展

周斯悦 综述,段 勇 审校

(昆明医科大学第一附属医院检验科/云南省检验医学重点实验室/云南省实验诊断研究所,云南昆明 650032)

外泌体是一种具有脂质双层膜结构的球型纳米级胞外囊泡，直径50～100 nm[1]，最早由JOHNSTONE等[2]在研究绵羊网织红细胞成熟过程中发现,由细胞膜内陷后通过一系列复杂机制生成的多胞体(MVBs)释放到细胞外环境中[3]。外泌体的形成与细胞分泌有关，受多种蛋白质调节，如Rab蛋白(Rab27A / B)、热休克蛋白70(HSP70)、肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)、ALG-2相互作用蛋白X(Alix)和四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81和CD82)[4]。在正常或病理条件下，几乎所有类型的细胞都可分泌外泌体，如网织红细胞、免疫细胞、上皮细胞，但肿瘤细胞能分泌更多的外泌体。外泌体含有多种生物活性分子，包括蛋白质、核酸、脂质，在许多病理及生理过程中发挥重要作用，并且能将信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能，是细胞间信息传递的重要方式[5]。外泌体天然存在于体液中，包括血液、尿液、唾液、乳汁、胆汁、羊水、腹水及脑脊液等。

肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，可分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)，前者占80%，具有易转移复发、恶性程度高的特点。我国是肺癌高发国，2015年中国分地区肿瘤和死亡分析显示，我国东、中、西部常见恶性肿瘤中肺癌均排名首位，也是肿瘤死亡的常见原因[6]。2012年肺癌在男性以及欠发达国家的肿瘤相关死亡原因中居首位，尽管针对肺癌诊疗的研究已经取得较大进展，但肺癌预后情况仍不理想，5年生存率并未明显改善。主要原因是肿瘤得不到早期诊断，会发生早期转移[7]。因此，迫切需要发掘有助于肺癌早期诊断的新型标志物。研究发现，外泌体参与调节肿瘤发生的多个过程，包括促进肿瘤血管形成、调节肿瘤微环境中的免疫应答、上皮间质转化、促进肿瘤细胞侵袭与转移等。近年来，外泌体的研究特别是在肿瘤领域的研究是一个热点。笔者就近年来外泌体在肺癌发病机制及诊疗中的研究进展进行综述，展望该领域的发展前景。

1 外泌体在肺癌发生发展、转移中的作用

1.1外泌体促进肿瘤血管生成 肿瘤血管生成在肿瘤发生、发展中有着关键作用，学者们已经证实外泌体可促进肿瘤血管生成。LIU等[8]的研究表明，外泌体中的miR-21可以激活STAT3，从而增加血管内皮生长因子受体(VEGF)的表达，最终诱导人支气管上皮细胞的血管生成和恶性转化。CUI 等[9]研究表明过表达基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP-1)通过激活CD63/PI3K/AKT/HIF-1通路促进来源于肺腺癌、包含miR-210的外泌体分泌，并最终证实其在体外实验中刺激肿瘤血管生成。HSU等[10]发现了外泌体中的miR-23a 在低氧和正常氧条件下都可促进肿瘤血管生成，从而表明缺氧肿瘤癌细胞和远离肿瘤的正常氧环境中的内皮细胞之间可以传递遗传物质。ZHUANG等[11]的研究证明通过激活JAK-STAT信号通路，外泌体中miR-9可以促进血管生成。这些结果表明肺癌来源的外泌体促进血管生成，从而可能导致癌症的发生和发展。

1.2外泌体可调节肿瘤微环境中的免疫应答 外泌体有调节肿瘤微环境中免疫应答的能力，从树突状细胞(DC)释放的外泌体可携带肿瘤抗原，激活免疫应答。GUO等[12]的研究团队发现来源于DC细胞的外泌体与抗癌药物环磷酰胺(CTX)、具有促DC细胞成熟作用的干扰素诱导剂聚肌胞苷酸(poly I:C)联合使用能在体内和体外实验中增强抗肿瘤活性。FABBRI等[13]研究表明，来自肺癌细胞的外泌体miR-21 、 miR-29a可以作为Toll样受体(TLR)的配体，最终导致肿瘤生长和转移。因此，作为TLR的旁分泌激动剂，外泌体miRNA可以调节肿瘤微环境中的免疫应答。此外，活化的表达FasL的CD8+T细胞分泌的外泌体可激活ERK和NF-κB通路，导致MMP-9表达增加从而促进肺癌转移[14]。

1.3外泌体促进上皮-间充质转化(EMT) EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，它赋予细胞转移和入侵的能力，在肺癌的发生发展中起重要作用。RAHMAN等[15]研究表明，来源于高转移性肺癌细胞和晚期肺癌患者血清的外泌体能够诱导人支气管上皮细胞(HBECs)中的波形蛋白表达和EMT。KIM等[16]研究了EMT中涉及的外泌体内容物的变化。在A549人肺腺癌细胞系中，外泌体的蛋白质含量(β-钙黏蛋白)反映了细胞表型的变化，miR-23a表达也显著增加。

1.4外泌体在肺癌转移中的作用 WANG等[17]的研究发现，与NSCLC NCI-H2228细胞相比，在SCLC NCI-H1688细胞中观察到外泌体中TGF-β和IL-10水平升高，在低氧条件下更甚。也发现肺癌细胞分泌的外泌体内TGF-β和IL-10表达升高与肺癌转移相关。免疫检查点蛋白是指在免疫系统中存在的一系列抑制信号的分子，含有T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的分子3(Tim-3)是新一代免疫检查点蛋白，可被其配体Galectin-9激活，从而负向调节抗肿瘤免疫应答。GAO[18]等学者研究发现患者血浆内的Galectin-9高表达水平与肿瘤转移相关。HOSHINO等[19]的研究表明，外泌体整合素α6β4和α6β1与肺癌转移相关。ZHANG等[20]的一项研究显示，与健康人相比，NSCLC患者中外泌体lncRNA MALAT-1高表达。 此外，外泌体MALAT-1高表达与晚期肿瘤分期和淋巴转移相关。这些机制都可成为肿瘤治疗的潜在靶点。

2 外泌体在肺癌诊断、评估预后中的作用

外泌体可作为诊断肺癌及评估预后的新型生物标志物。首先，外泌体可反映其亲代细胞的生理状态和微环境，并且大多数细胞分泌的外泌体含有特定蛋白质、核酸等。其次，外泌体存在于血液和其他体液中，分布广泛。由于具有磷脂双分子层，外泌体在细胞外环境中非常稳定。至今为止，已经报道了许多来源于外泌体的miRNA、lncRNA以及蛋白质等可作为肺癌潜在的诊断、预后生物标志物。

2.1外泌体miRNA ZHOU等[21]检测了6种肺腺癌患者外周血中提取的外泌体miRNA(miR-19b-3p、miR-21-5p、miR-221-3p、miR-409-3p、miR-425-5p和miR-584-5p)。其中，miR-19-3p、miR-21-5p和miR-221-3p显著上调。此外，LIN等[22]发现27种来源于肺炎和肺癌的胸腔积液外泌体中差异表达的miRNA。在这些miRNA中，miR-205-5p和miR-200b在肺癌样本中显著上调，表明这两种miRNA可能具有鉴别肺癌和肺炎的潜力。上述研究中检测的外泌体miRNA并未涉及肺癌的早期诊断，因为在这些研究中没有选择特定临床阶段的患者。在近期的一项研究中，JIN等[23]对46例Ⅰ期NSCLC患者和42例健康人对照组分离的外泌体进行miRNA-seq分析以鉴定NSCLC患者外泌体miRNA的早期诊断价值。发现了由4个miRNA：let-7b-5p、let-7e-5p、miR-23a-3p和miR-486-5p组成的miRNA诊断小组，可用于诊断Ⅰ期NSCLC，受试者工作特征曲线(ROC)的曲线下面积(AUC)为0.899，灵敏度为80.25%，特异度为92.31%。该课题组还检测了4种腺癌特异性外泌体miRNA，包括miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p，ROC AUC为0.936，灵敏度为80.65%，特异度为91.67%。检测了3种鳞状细胞癌特异性外泌体miRNA：miR-10b-5p、miR -15b-5p和miR-320b，ROC AUC为0.911，灵敏度为83.33%，特异度为90.32%。结果显示，这两个组合具有区分NSCLC患者腺癌或鳞癌的潜力，这一研究说明外泌体源性miRNA不仅可应用于肺癌分期，还可用于判断肺癌分型。此外，GRIMOLIZZI等[24]学者的研究发现，miR-126在晚期患者的血浆中水平下调；还发现来源于细胞的外泌体miR-126能够诱导正常人支气管上皮细胞的恶性转化，而相反，来源于人支气管上皮细胞中的外泌体miR-126能够抑制细胞生长且诱导恶性缺失。这表明外泌体miRNA在调节微环境中有重要作用，其作为诊断标志物在个性化治疗领域有广阔前景。

2.2外泌体蛋白质 外泌体中除了miRNA外，还存在多种蛋白质，外泌体蛋白质也可以作为诊断标志物。SANDFELD-PAULSEN等[25]研究了49种外泌体膜附着蛋白在336例肺癌患者和127例健康对照中的诊断潜力。发现CD151、CD171和tetraspanin 8是可以明显区分肺癌患者和非肺癌患者的生物标志物。此外，研究者也使用276例NSCLC患者的血清样本评估了49种蛋白质作为预后标志物的潜力。他们发现5种蛋白质(NY-ESO-1、EGFR、PLAP、EpCam和Alix)对预测肺癌患者长期生存率有效，可以作为肺癌潜在的预后标志物。除了血液，研究人员还发现了来自其他体液的外泌体蛋白：富含亮氨酸的α-2-糖蛋白(LRG1)与蛋白质相互作用、信号转导、细胞黏附等过程密切相关，在NSCLC患者组尿液和组织外泌体中表达水平高于健康组。因此，除血清外，尿液外泌体也可能成为检测肺癌的潜在标志物[26]。PARK等[27]从NSCLC患者的恶性胸腔积液中分离出高纯度的外泌体，并发现了潜在的诊断标志物：EGFR、K-ras、basigin、癌胚抗原相关细胞黏附分子6、claudin1、claudin3和RAB家族蛋白。

2.3其余外泌体内含物 除了miRNA、蛋白质以外，外泌体中还含有其他分子，如长链非编码RNA(lncRNAs)、环状RNA(circRNA)。ZHANG等[20]的一项研究显示，与健康人相比，NSCLC患者外泌体长链非编码RNA(lncRNA) MALAT-1高表达。此外，LI等[28]的研究结果表明，环状RNA(circRNA)在血清外泌体中含量多并且稳定。外泌体血清circRNAs可以区分结肠癌患者和健康人。这些结果表明，外泌体circRNA、外泌体lncRNA有望成为诊断癌症的生物标志物。

3 外泌体在肺癌治疗中的作用

3.1外泌体作为药物递送载体 外泌体作为药物递送载体具有多个优点，如外泌体的磷脂双分子层可防止药物在短时间内降解，具有稳定性，并且利于外泌体与靶细胞膜直接融合；外泌体具有较低的免疫原性和毒性；外泌体由特定细胞释放，可作为细胞间传递信号的载体。有研究已经报道外泌体可作为天然的药物递送载体：SRIVASTAVA等[29]研发了一种含有阿霉素的外泌体递送系统，并证明了这一系统对H1299和A549肺癌细胞系具有抗癌活性。紫杉醇(PTX)是一种具有抗癌活性的二萜生物碱类化合物，有研究者将巨噬细胞衍生的外泌体包裹紫杉醇制成外泌体制剂(exoPTX)，表面修饰氨基乙酰胺聚乙二醇(AA-PEG)。可通过受体介导的内吞作用在肺癌细胞中积累，其药物水平高于运用非外泌体包裹的水平。即使用工程化的巨噬细胞外泌体进行靶向紫杉醇药物递送可增强肺癌转移的治疗效果[30]。但要使用外泌体作为药物递送载体尚存在一些问题，例如，如何在不破坏外泌体结构的条件下将药物载入外泌体内；如何控制外泌体药物的释放，提高药物传递效率等。

3.2外泌体改变药物敏感性的作用 众多研究团队报道了耐药性与多种因素相关，外泌体可能为潜在的机制。一些研究已经报道了外泌体对肺癌药物[顺铂和表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)]和放射疗法耐药性的影响。LI等[31]发现来源于吉非替尼处理的细胞外泌体降低了顺铂的敏感性，而源自顺铂处理过的细胞的外泌体没有改变吉非替尼的敏感性。如果加入GW4869(一种外泌体分泌抑制剂)，则可观察到顺铂和吉非替尼具有协同作用。这些结果表明，抑制外泌体的分泌可以降低EGFR-TKIs与化疗药物之间的拮抗作用，提高药物敏感性。另一项研究报道了外泌体内中间变性淋巴瘤激酶(ALK)对ALK抑制剂色瑞替尼(Ceritinib)敏感性的降低作用[32]，作者观察到内含ALK外泌体的处理组能够导致肿瘤细胞生长加快以及色瑞替尼敏感性降低，表明外泌体中ALK蛋白是促进肿瘤生长以及损害ALK抑制剂(色瑞替尼)对ALK阳性的非小细胞肺癌治疗效果的关键因素。肿瘤耐药受多种因素调控，外泌体由于包含核酸、蛋白等物质，在细胞间通讯中发挥重要作用，而肿瘤利用了这种通讯机制从而改变药物的敏感性。

4 小 结

外泌体是内含核酸、蛋白质、脂质等的细胞外囊泡，在许多生理与病理过程中发挥重要作用，并且能将信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能，是细胞间信息传递的重要方式。越来越多的研究显示其可以在肺癌的发生发展中起促进作用，检测外泌体内容物有助于肺癌的诊断、治疗与预后评估。但有关外泌体如何形成、其发挥作用的功能机制以及靶分子和信号通路的研究尚未完全清楚。此外，目前有关外泌体检测的分离、纯化、定量等步骤尚没有标准化方法，所以仍需对外泌体进行更加深入的探索，更好地阐明外泌体在肺癌中的作用机制，利用外泌体研发出更多有效的治疗、诊断方法，为肺癌的诊断、治疗提供新思路。