肝癌外泌体miRNAs研究进展

王秀芹，路其凤 综述，司元全 审校

(山东大学附属省立医院临床医学检验部，山东济南 250021)

肝细胞癌(HCC)发病率在世界恶性肿瘤中居第5位，病死率位居第3位。我国HCC发病率和病死率分列所有恶性肿瘤的第4位和第3位，其预后差且复发风险高。目前，HCC诊断标志物主要是甲胎蛋白(AFP)和异常凝血酶原Ⅱ(PIVKA Ⅱ)，前者在妊娠生理情况下或重型肝炎、肝硬化等良性疾病患者血清中也会升高。35%～40%的原发性HCC患者血清AFP呈低水平升高，尤其是小HCC，AFP水平升高不明显，甚至正常[1]。PIVKA Ⅱ检测结果影响因素较多，如凝血功能异常、肝硬化等均可引起其水平升高，这些因素可能会影响其对原发性肝癌的诊断[2-3]。肝肿瘤切除术、肝移植、介入放射治疗和化疗栓塞仍是HCC治疗的主要选择。但其预后效果不理想。因此，早期HCC的诊断迫切需要有效的、灵敏的、特异的生物标志物。另外，HCC治疗还需更多的、有效的生物疗法。有研究表明，外泌体miRNAs在HCC的发生、发展中发挥着重要作用，随着大量的相关研究成果的陆续出现，可以预见，外泌体miRNAs在HCC诊治方面将占有越来越重要的地位。本文总结了近年来外泌体miRNAs与HCC之间关系的研究成果，以期更好地了解其在HCC诊治方面的功能和应用。

1 外泌体与外泌体miRNAs概述

外泌体是直径约为30～150 nm、密度为1.13～1.21 g/mL的小囊泡，包含RNA、蛋白质、miRNA、DNA片段等多种成可分。可存在于血液、唾液、尿液和母乳等体液中，包括肿瘤细胞在内的几乎所有类型细胞均可产生并释放外泌体[4]。有研究表明，外泌体参与了细胞间信号传导，有望在多种疾病的早期诊断中发挥作用。

miRNAs是一类内源性具有调控功能的非编码RNA，其能与特定的目标信使RNA(mRNA)的3′非编码区结合，并在转录后水平引起靶mRNA的降解或抑制其翻译，从而对基因进行表达调控。近年来，miRNAs在恶性肿瘤诊治方面的应用越来越多[5]。有研究表明，miRNAs不仅可作为HCC诊断和预后评估的敏感生物标志物，且还可用于HCC的治疗。外泌体miRNAs较单纯miRNAs在检测和治疗HCC方面更灵敏，且其稳定性较miRNAs大得多，因此，其具有更重要的生物学特性。最近有研究表明，外泌体miRNAs参与了HCC的增生、凋亡、抑制等，同时，影响其侵袭、转移及预后，诱导免疫耐受及耐药性形成。HCC外泌体可能通过不同种类miRNAs的异常表达间接调控HCC的致病机制，是影响HCC发病的最重要成分之一[6]。

2 外泌体miRNAs在HCC发生、发展中的作用

有研究表明，多种外泌体miRNAs介导肿瘤与肿瘤微环境之间的生物信息传递，参与了HCC细胞增殖、转移、免疫逃逸等进程。

2.1外泌体miRNAs与HCC细胞增殖 miR-122是一种肝脏特异性抗增殖miRNA，将人HCC细胞Huh7和HepG2(miR-122缺陷)共培养后，后者吸收培养液中外泌体miR-122。miR-122可有效抑制HepG2细胞靶mRNA的表达，并降低受体HepG2细胞的生长和增殖速度。且在2种细胞共培养过程中HepG2细胞分泌胰岛素样生长因子1(IGF-1)，减少miR-122在Huh7细胞中的表达。因此，2种不同的HCC细胞之间存在相互影响，且这种相互作用是通过细胞间外泌体介导的miR-122转移来实现的[7]。HCC患者血清外泌体中的miR-9-3P水平明显降低，成纤维细胞生长因子5(HBGF-5)在细胞增殖中具有重要作用，后者是miR-9-3P潜在的靶mRNA，miR-9-3p的过表达显著下调了HBGF-5在mRNA和蛋白水平的表达，进而影响了HCC细胞的存活率和增殖[8]。最近有研究表明，在癌相关成纤维细胞(CAF)衍生的外泌体中miR-320a水平显著降低。体内外研究表明，miR-320a可通过直接与下游靶——PBX3结合而抑制HCC细胞增殖[9]。miR-142和miR-223存在于巨噬细胞内而HCC细胞内没有，有研究表明，HCC细胞可摄取巨噬细胞所分泌的含miR-142和miR-223的外泌体，抑制stathmin-1和IGF-1的表达，进而抑制这些癌细胞的增殖[10]。

2.2外泌体miRNAs与HCC转移 HCC介导的外泌体miRNAs能促进其局部扩散，诱导HCC肝内转移或多灶性生长。有研究表明，来自HCC细胞的外泌体miRNAs可调节转化生长因子β活化激酶-1的表达和相关信号传导，并促进受体细胞的生长和侵袭[11]。在另一项研究中外泌体miR-335-5p在体外抑制HCC细胞增殖和侵袭，并在体内诱导HCC萎缩[12]。有研究表明，迁徙能力强的HCC细胞系的外泌体携带大量的miRNAs，可显著提高非运动性细胞的迁移和侵袭能力[13]。有研究使用丙型肝炎病毒E2包膜糖蛋白刺激肥大细胞后发现，刺激后外泌体内共计19个差异表达的miRNAs，其中miR-490水平显著提高。后者可增加HepG2细胞miR-490水平，从而抑制ERK1/2通路进而最终抑制HCC的转移[14]。临床资料显示，血清外泌体miR-1247-3P水平与HCC患者肺转移密切相关[15]。

2.3外泌体miRNAs与HCC肿瘤微环境 肿瘤微环境是指肿瘤的发生、发展与肿瘤细胞所处的内外环境具有密切的关系。肿瘤外泌体是介导局部和远处微环境中肿瘤细胞和基质细胞之间的细胞间通讯的关键介质[16]。CHEN等[17]发现，外泌体miRNAs参与了由环境化学物质引起的HCC癌变过程中的细胞间信号传导，其中miR-155增强炎性反应，其表达水平与白细胞介素-6(IL-6)和IL-8呈正相关。CAFs作为肿瘤微环境的一个重要组成部分，几乎与所有癌症疾病的发展过程相关，而外泌体miRNAs的异常调节促进了CAFs的产生和激活[15,18]。最新研究表明，高转移的HCC细胞的外泌体miR-1247-3p可促进肺转移小龛的形成，从而诱导CAFs活化，加速了HCC的肺转移[15]。ZHANG等[9]分离出CAFs及癌旁相关成纤维细胞(PAFs)发现，miR-320a在CAFs及HCC细胞中表达水平较低，而在PAFs中表达水平相对较高，提示CAFs介导的HCC肿瘤进展与其外泌体中抗肿瘤miR-320a的缺失相关。

3 外泌体miRNAs与HCC诊断、预后评估及治疗

HCC一般不易诊断，大多数HCC患者被确诊时已处于中晚期。目前，HCC常规治疗方式效果不尽理想。因此，早期HCC的诊断迫切需要灵敏的、特异的生物标志物。此外，还需更多有效的治疗HCC的生物疗法及评估HCC患者预后的生物指标。有研究表明，外泌体miRNAs正是符合这一要求的理想标志物。

3.1外泌体miRNAs与HCC诊断及预后评估 不同外泌体miRNAs在HCC血清或细胞培养液中表达可上调也可下降。有研究发现，HCC患者血清外泌体miR-665水平明显高于健康受试者。HCC血清外泌体miR-665水平与肿瘤大小、局部浸润、临床分期和生存时间均密切相关，血清外泌体miR-665水平越高，患者临床情况越差，表明血清外泌体miR-665可能是一种用于HCC诊断和判断预后的新的微创性生物标志物[19]。另外，有研究表明，HCC患者血清外泌体miR-21水平高于乙型肝炎患者和健康对照组，血清外泌体miR-21水平与肝硬化或晚期肿瘤的发生密切相关。尽管血清miR-21具有类似的结果，但检测灵敏度远低于血清外泌体miR-21[20]。另一项研究结果显示，HCC患者血清外泌体miR-18a、miR-221、miR-222、miR-224水平显著高于慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化患者，但血清相关miRNAs水平在HCC组和对照组之间的差异较小[21]。表明血清外泌体miRNAs与血清循环miRNAs水平相比，能更好地用于HCC的诊断及预后评估。此外，也有研究表明，HCC外泌体miRNAs表达下降，HCC患者血清外泌体miR-101、miR-106b、miR-122、miR-195较CHB和肝硬化患者表达水平显著降低[21]。另外，HCC患者血清外泌体中的miR-9-3P表达水平明显低于健康对照组[8]。另一项研究表明，HCC患者血清外泌体miR-638与肿瘤大小、血管浸润、临床病理分期呈负相关，外泌体miR-638表达降低常提示HCC患者预后不良[22]。肝移植术后复发的HCC患者血清外泌体miR-718水平较未复发者低，miR-718丢失与HCC预后不良有关[23]。另一项研究表明，HCC血清外泌体miR-125b表达水平与肿瘤数目和病理分期有关，低水平miR-125b HCC患者常伴较短的复发时间和较低的总生存率。外泌体miR-125b可作为评估HCC患者预后的准确、有效的指标[24]。总之，血清外泌体miRNAs可作为判断HCC患者预后的新的生物标志物。

3.2外泌体miRNAs与HCC治疗 外泌体miRNAs相关研究为癌症治疗提供了新的方向，作为一种有效的抗HCC的免疫治疗方式，理论上减少了潜在的不良反应。脂肪源性间充质干细胞(AMSC)可稳定产生外泌体，后者表现出有效的免疫活性[25]。miR-122是影响肝脏发育和代谢功能的关键因素，其缺失与HCC密切相关[26]。将表达miR-122质粒转染至AMSC，收集AMSC产生的外泌体(122-EXO)并加入到受体HCC细胞(HepG2)中。结果显示，miR-122转染的AMSC能有效产生富含miR-122的外泌体，通过改变HCC细胞中miR-122靶基因的表达而使癌细胞对化疗药物敏感。此外，瘤内注射122-EXO可显著提高索拉非尼在体内对HCC的抗肿瘤作用[27]。正如前文所述，星状细胞衍生的外泌体miRNA(如miR-335-5p)可在体内递送诱导HCC萎缩；CAF衍生的外泌体中miR-320a抑制HCC进展。这均为HCC提供了新的治疗方案[9,12]。治疗HCC，除直接将抑制肿瘤外泌体miRNAs转移至HCC细胞外，还可用外泌体miRNAs调节肿瘤微环境。具体而言，CAFs、免疫细胞或肿瘤内皮细胞均可由外泌体miRNAs调控。T淋巴细胞衍生的外泌体miRNAs(主要是miR-92a)可在抗原呈递细胞中发挥功能，促进免疫应答[28]。调节性T淋巴细胞将外泌体miRNAs转移至辅助性T淋巴细胞，其中外泌体Let-7d有助于抑制和预防全身性疾病[29]。因此，外泌体miRNAs可作为HCC的潜在免疫治疗方式。

4 面临问题

如前文所述，外泌体miRNAs在HCC诊疗及预后评估方面均具有重要的应用价值，但也存在一些问题。首先是外泌体提纯问题：当前外泌体提纯方法(试剂)多种多样，提取的数量和质量效果均存在差异，目前公认的分离方法依然是超速离心法，但该方法耗时长且缺乏较统一的标准。此外，用于分离外泌体的试剂非常昂贵。因此，建立低成本且节省时间的分离和纯化方法是非常必要的。

其次在外泌体miRNAs用于HCC诊断及预后评估方面：对同一种外泌体miRNA不同的研究有不同的结论。一方面是由于研究中所包含的研究对象数量不够；另一方面是研究对象之间的个体差异较大，导致后续的生物信息学检测结果也可能发生变化。因此，在分析HCC外泌体miRNAs的差异表达时研究者必须考虑各种因素，如年龄、性别、病毒感染和疾病的所处阶段。以后应检测更多的包括HCC各阶段的样本来提高血清外泌体miRNAs测定结果的可靠性，使其真正成为HCC诊断及预后评估的稳定、准确的生物标志物。

最后在其用于HCC治疗方面：正如前文所述，外泌体miRNAs介导的HCC治疗首先应保证足够数量和优质质量的外泌体；此外，将所期望的miRNAs结合到外泌体中仍是一个挑战。除将表达过量miRNAs的质粒转染至供体细胞外[27]，也可通过电穿孔方式实现将miRNAs转至外泌体中[30]；另一个有待解决的关键问题是如何提高受体细胞摄取包含所需miRNAs外泌体的能力。相关研究表明，在转染液泡分选蛋白4A(Vps4A)过表达质粒的SMMC-7721细胞中，6种抑制肿瘤miRNAs显著上调，Vps4A增强了HCC细胞中外泌体对肿瘤抑制miRNAs的摄取[31]。总之，外泌体miRNAs用于HCC治疗前景广阔，但临床应用尚有待于进一步研究。

综上所述，外泌体miRNAs不仅有助于HCC的早期诊断和预后评价，还可作为一种新的治疗模式。但目前对外泌体miRNAs的相关研究仍处于探索阶段，为更全面地弄清外泌体miRNAs与HCC的关系尚需更深层次的研究。随着外泌体miRNAs研究的不断深入，其在HCC的诊治及预后评估中将会发挥越来越重要的作用。