循环肿瘤DNA的临床应用研究进展

程筱雯

1948年，法国科学家Mandel首次描述了人类血液中存在游离的无细胞核酸片段（cell-free DNA，cfDNA）。1977年，Leon等［1］第一次报告了肿瘤患者血清中cfDNA水平增高，远高于健康人群。随后不久研究者［2-4］就在肿瘤患者血液中发现了与结直肠癌、胰腺癌及肺癌相关的KRAS突变，而且在血浆中发现的KRAS突变与患者肿瘤组织中发现的KRAS突变相同，证实了血浆中的突变DNA片段来源于肿瘤，突变的cfDNA是肿瘤高度特异性的生物学标志物，研究者从而提出了“循环肿瘤DNA”（circulating tumor DNA，ctDNA）的概念，ctDNA是一些从肿瘤细胞释放至血液中的DNA片段。

Vogelstein［5］在 1999 年利用数字 PCR（digital PCR，dPCR）技术实现了罕见突变片段的准确识别和绝对量化，使在不同病情阶段的结直肠癌患者血浆中突变的等位基因比例得以量化。2012年，Forshew等［6］使用标记的扩增子片段对cfDNA中多个基因进行了深度测序，证明了直接在癌症患者血浆中鉴定突变的可能性，且能够在单个测定中监测多种肿瘤特异性突变。此后不久，血浆cfDNA的全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）被证明能够识别肿瘤衍生的染色体畸变、聚焦扩增和基因重组［7-8］。2013年新英格兰医学杂志指出，无创ctDNA检测能够真实反映实体瘤组织中基因突变频率及图谱，是疗效评估及预后监测的重要指标［9］。

本文主要从ctDNA检测方法、ctDNA在肿瘤精准医疗中的应用及ctDNA检测分析面临的挑战等方面进行综述，以期进一步探讨ctDNA切实可行的临床应用方向。

1 ctDNA的检测方法

1.1 dPCR

微流控平台上的dPCR被广泛用于量化ctDNA 水平［10］。dPCR 是分配扩增，终点检测，先将样品稀释到单分子水平，再平均分配到20 000个单元中进行反应，每个单元包含一个或多个拷贝DNA模板，在每个反应单元中分别对靶分子进行PCR扩增，扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行收集，利用泊松分布的数学模型计算目标片段拷贝数，可以实现单分子DNA绝对定量。dPCR可更好地检测稀有突变，且常用于癌症热点突变分析，其缺点是仅检测已知突变且通量低，如样品需分成多个反应，会增加采样误差，并损害极低拷贝数突变体DNA检测的整体性能。

1.2 扩增受阻突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）

该法检测已知突变，利用模板和引物碱基错配有效抑制PCR反应区分等位基因。根据已知点突变设计引物，其3′端碱基分别与突变和正常模板碱基互补，碱基与模板互补后，则引物不间断延伸，PCR正常进行得到特定长度扩增带。反之，则不能延伸，从而区分有某种点突变的模板与正常模板。该法检测灵敏度高，检测限可达100 copies/mL，对肿瘤组织检测限可达到0.1%的突变率［11］。ARMS结合实时PCR可实现闭管扩增，步骤简便，产物无需后处理，从而最大程度地防止了扩增产物污染，现已成为国际上肿瘤个体化分子检测最重要、最先进的技术之一，临床应用认可率高［12］。

1.3 磁珠乳液扩增方法（bead emulsion amplification magnetic，BEAMing）

该方法结合流式细胞术和dPCR，利用特异性引物扩增靶突变区，与磁珠混合进行油包水单分子扩增反应。磁珠上固定有特异PCR引物，每一类DNA分子专一与磁性珠相连。反乳化过程使得颜色各异的荧光探针结合磁珠上的PCR产物，发出绿色或红色荧光，使用流式细胞仪分析磁珠颜色来确定突变情况。这种方法是基于小珠（bead）、乳浊液（emulsion）、扩增（amplification）、磁性（magnetic）这4个主要组分来构建的，故被称为BEAMing。该法用于检测血液样品中低拷贝数的已知基因突变效果较好。但此技术成本高、操作复杂，且成功率偏低，目前临床应用率低［13］。

1.4 测序技术

NGS技术的出现使得在保证敏感性的基础上检测出尽可能多的ctDNA中肿瘤特异性的基因突变或是拷贝数异常成为可能，包括未知突变的检出。NGS的优势是能一次性对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，通过增加测序深度可使灵敏度达到0.01%甚至更高的水平，是目前公认最有效的分析方法［14-16］。

标记扩增深度测序（tagged-amplicatiom deep sequencing，TAM-Seq）技术利用定制化突变位点库作为筛选器，对样本进行靶向捕获后再进行深度测序，其对肿瘤灵敏度更高，特异性更强，与全外显子测序相比经济可行。肿瘤个体化深度测序（cancer personalized protiling by deep sequence，CAPP-Seq）技术的基本原理是先利用特异性引物进行15个循环目标区域预扩增，再利用不同特性的接头标签进行二次扩增，通过双向重复测序提高了测序精度，特异性和敏感性较高，成本较低，适于临床应用［17］。TAM-Seq和 CAPP-Seq主要针对已知突变检测，而全基因组测序、全外显子测序技术则可检出未知突变。然而，上述测序在临床实际应用中尚存在诸多问题，由这些技术带来的昂贵费用和庞大数据，及如何获取高质量DNA样本是目前需要克服的问题［15，18］。

2 ctDNA在肿瘤精准医疗中的应用

2.1 ctDNA与肿瘤的分期和预后相关

一项包括有640例不同类型和分期的癌症患者的研究发现，Ⅳ期癌症患者的ctDNA浓度与Ⅰ期患者相比增加了100倍［19］，表明血浆中ctDNA的浓度可能与肿瘤发展阶段相关。ctDNA浓度变异主要由癌症转移扩散程度或疾病负荷的差异造成。有实验提示复发性高级浆液性卵巢癌患者ctDNA水平与肿瘤体积显著相关，肿瘤体积每增加1立方厘米，每毫升血浆则增加6个突变体拷贝［20］。ctDNA浓度显著变化可能与个体差异相关，如肿瘤血管形成可能阻碍ctDNA释放入血液，或者可通过产生缺氧和细胞死亡来促进ctDNA释放。ctDNA水平与癌症分期关系表明ctDNA可作为预后指标［21-22］。具有可检测ctDNA的结直肠癌患者的2年总体生存率为48%，而没有ctDNA的患者则为100%［23］，相比常规蛋白质类肿瘤标志物，ctDNA是具有更好监测效果的预后预测因子，ctDNA浓度越高，影像学检查结果和临床疗效就越差。一项对转移性乳腺癌的研究发现ctDNA浓度与总体存活率间存在显著相反关系，ctDNA浓度高于2 000 copies/mL的患者预后均很差［24］。

2.2 ctDNA在肿瘤早期诊断中的应用

癌症的早期干预可明显改善患者生存质量，许多研究已证明了无创技术进行疾病早期诊断的潜在价值［25-26］。有研究显示82%Ⅳ期癌症患者检测到ctDNA，而Ⅰ期患者检出率在47%［19］。50%Ⅰ期非小细胞肺癌（non small-cell lung cancer，NSCLC）患者可检测到ctDNA［27］。使用dPCR技术在早期乳腺癌患者血浆中显示了93.3%的突变敏感性［28］。一种基于无创产前检测（noninvasive prenatal testing，NIPT）技术改编的浅层全基因组测序（shallow whole-genome sequencing，sWGS）方法最近被应用于临床研究，检测出了16例早期卵巢癌病例中的6例（37.5%）［29］。这些研究提示了早期癌症中ctDNA检测的可能性。

2.3 ctDNA在肿瘤组织定位中的应用

cfDNA中的甲基化和核小体占有模式可以编码组织特异性和细胞特异性信息，研究血浆中组织特异性甲基化信号，使每个组织对整个cfDNA池的相对贡献量子化，这使得今后通过测定组织特异性ctDNA来确定癌症转移扩散部位或位点成为可能［30-31］，即提示了来自液体活检的原始组织信息可能有助于肿瘤定位。

2.4 ctDNA在肿瘤病情实时监测中的应用

ctDNA半衰期短以及可重复采样的特点，使液体活检能够实时监测肿瘤负荷对治疗效果的反应程度。在治疗期间对患者进行的研究显示［6，32］，ctDNA 动力学与治疗反应相关，并且可以比临床检测更早地识别反应。在复发性卵巢癌中，化疗后ctDNA减少程度与进展时间显著相关，并且比CA125水平更有价值［20］。

最近的一项研究表明［33］，在黑素瘤患者免疫治疗开始后的第一周，ctDNA水平的早期尖峰可能反映出细胞死亡数目的短暂增加，然而，这种细胞死亡峰值可能会根据所使用的药物的药理学特性和对它们的生物反应而变化。在结直肠癌患者化疗早期以及NSCLC患者接受表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGER）抑制剂治疗后早期，未发现早期尖峰的出现，如果在治疗开始后立即对血浆进行分析可以可靠地检测出敏感性癌细胞的破坏，这表明也许可以利用突变的早期动力学差异来快速鉴定抗性亚克隆的存在［34］。在免疫治疗的背景下，液体活检可以通过从不同的T细胞克隆释放的cfDNA的分析来提供监测ctDNA和免疫系统反应的机会［35］。另外，在手术或治疗后，没有任何其他临床证据时，ctDNA的存在可识别可能患有复发风险的患者，即ctDNA的检测有助于微小残留病（minimal residual disease，MRD）的诊断［36］。

2.5 ctDNA在肿瘤异质性分析中的应用

在对肿瘤的深入研究中，人们逐渐认识到肿瘤异质性的潜在混杂效应，但对患者行多次肿瘤活检通常既不可行也不可取。单独活检的分析可能无法准确反映患者基因组结构，进而会对个性化药物的选择和疗效产生错误判断。ctDNA从多个肿瘤区域释放，从而可以反映肿瘤异质性和空间分离的病灶，ctDNA分析可检测到在相应组织样品中已经漏掉的突变［37］，比传统活检更全面地分析肿瘤异质性。有一项晚期胃癌ctDNA的研究分析了70例晚期胃癌患者ctDNA和配对肿瘤组织中人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor recepter，HER2）扩增的一致性，比较了其中30例晚期胃癌患者的ctDNA和原发肿瘤的突变谱，其中5例患者多次组织活检以对肿瘤突变进行综合分析，结果显示ctDNA中大多数突变也显示在成对的肿瘤组织中，ctDNA与肿瘤组织的HER2扩增具有高度一致性（91.4%，Kappa指数=0.784，P＜0.001），这意味着基于ctDNA的评估可以部分克服肿瘤的异质性，并可能成为胃癌HER2分析的潜在替代指标［38］。

多区域肿瘤测序数据显示［39-40］，肿瘤原发灶和转移灶组织中存在相同的固有突变，这种固有突变在血浆ctDNA中的检出率高于区域肿瘤的个体突变检出率，因此检测这种固有突变对于跟踪血浆肿瘤负荷（肿瘤负荷是指人体中肿瘤细胞的数量、肿瘤的大小或肿瘤病灶的总量）将是一种可靠的方法。

3 ctDNA检测分析面临的挑战

尽管ctDNA与临床表型的相关性已得到证实，但要提高其在临床应用的准确性，仍需大规模人群队列研究，而提高ctDNA分析质量是成功应用的关键。提高ctDNA分析质量需考虑的重要因素之一是血液样品预分析处理，目前ctDNA分离程序涉及将血液样品送到实验室，通过离心分离血浆和从血浆中纯化ctDNA，程序复杂且耗时，且需对样品进行强烈处理，这可能导致ctDNA降解或血细胞溶解引起基因组释放，从而对样本造成污染。检测ctDNA的血液样本可通过含有独特抗凝剂和细胞稳定剂的特殊采血管进行采集、运输和保存，但在抽血后如能立即进行ctDNA纯化，最大限度地缩短处理样品和纯化所需总时间，将有利于进一步提高ctDNA分析质量，包括浓度和含量。ctDNA检测能否成为实现肿瘤早期筛查的特异性生物标记物取决于更高灵敏度的ctDNA浓度检测技术的发现。目前关于ctDNA的检测尚缺乏统一的行业质控检测标准，而对罕见变异的临床界定也仍需大量临床信息积累，同时测序技术的高成本及结果的解读还有待于完善等，这些都是现阶段ctDNA检测分析所面临的挑战。

4 展望

目前我们对cfDNA释放和清除机制的理解有限，不清楚不同部位肿瘤细胞释出的ctDNA或同一部位肿瘤的不同亚克隆体释出的ctDNA的种类、性质和数量是否与总ctDNA池（即血液中所有的ctDNA）呈现出正相关？肿瘤血管分布和代谢特性是否会影响ctDNA在血流中的分布？但现有研究充分表明ctDNA可能是药物开发、肿瘤异质性和克隆进化研究的有利研究工具。

ctDNA的临床应用将取决于患者和临床医生的实际情况、所需基础设施及其成本效益。组织活检对于癌症的组织学诊断来说依然是“金标准”。2016年，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准了血浆突变检测试剂的应用，而新兴的ctDNA突变检测临床试验也在积极进行，这是个性化肿瘤学检测的里程碑，表明ctDNA检测目前正在扩大临床应用，以使患者更大程度地受益。进一步探索ctDNA的生物学特性，改进技术使肿瘤无创分子分析的范围越来越广，为基因组研究开辟新途径，这将有助于大大提高临床诊疗的决策水平。