应用UPLC-Q-TOF-MS鉴定白酒酒糟中的水溶性多肽

2019-03-28 00:54魏冬范文来徐岩
食品与发酵工业 2019年5期
关键词:酒糟负离子水溶性

魏冬,范文来*,徐岩

1(教育部工业生物技术重点实验室(江南大学),江苏 无锡,214122) 2(江南大学 生物工程学院,酿造微生物与应用酶学研究室,江苏 无锡,214122)

白酒酒糟是高粱蒸煮加曲后经固态发酵、蒸馏后的残渣,含有较丰富的营养成分,包括粗蛋白、脂肪、糖类、维生素、无机盐和许多风味物质等,如鲜酒糟中粗蛋白含量约为6.99%,干酒糟中粗蛋白含量高达16.78%[1]。

早期研究大都关注酒糟中蛋白、淀粉、脂肪等常规营养成分的分析[1-2],自20世纪80年代开始,日本研究人员开始研究清酒糟的多肽,并在清酒糟中发现抗高血压的ACE抑制肽[3-4]。目前白酒酒糟中多肽成分的研究尚未见报道。

多肽常见的研究方法包括分离纯化和结构分析两方面。其中分离纯化方法主要有离子交换色谱法[5]、反相高效液相色谱法(reverse phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)[6]、电泳法[7]等技术,而常用的多肽结构分析技术主要有电喷雾离子化质谱(electrospray ionization-mass spectrometry, ESI-MS)[8]、基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)、核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)[9]等。

半制备RP-HPLC技术不仅分离效果好,而且兼具制备作用,是目前使用的较为广泛的分离制备方法[10]。Q-TOF-MS技术作为高分辨质谱具有分辨能力强、分析速度快等特点[11]。利用RP-HPLC的高效分离和Q-TOF-MS技术的灵敏性,对成分复杂的样品的鉴定和分析效果显著[12]。

本研究以浓香型白酒酒糟为对象,建立了半制备RP-HPLC分离技术,结合UPLC-Q-TOF-MS对酒糟中水溶性多肽进行分离、鉴定,并试图发现其中的功能性多肽。白酒酒糟中功能性多肽的研究对提高酒糟的附加值具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

浓香型白酒酒糟取自某酒业股份有限公司,当天取样后于-20 ℃条件下保存备用;超纯水(Millipore-Q系统);乙腈、三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA),Sigma-Aldrich公司,色谱级。

1.2 仪器与设备

冷冻离心机(Centrifuge 5418),德国Eppendorf公司;磁力加热搅拌器(MS-S),大龙兴创实验仪器有限公司;旋转蒸发仪(R-300RL),瑞士BUCHI公司;半制备型高效液相色谱仪(Waters 2767),美国Waters公司;Xbridge BEH C18反相色谱柱(10 mm×250 mm,5 μm),美国Waters公司;超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用仪,美国Waters公司。

1.3 酒糟前处理

取出在-20 ℃冰箱中储藏的白酒酒糟于常温下放置5 h解冻后备用;称取100 g酒糟样品,加入200 mL超纯水,于40 ℃恒温条件下搅拌60 min,将搅拌后的浑浊溶液进行离心(4 ℃,3 800×g,30 min),取上清液,用滤纸(Whatman No.2)过滤,进一步高速离心(4 ℃,10 000×g,20 min)。上清液经0.22 μm水系滤头过滤后用超滤管(截留分子量> 1 kDa)超滤,收集下层溶液,真空旋转蒸发,浓缩至原体积的1/20;再冻干后复溶至质量浓度为100 mg/mL(记为R)以备用。

1.4 半制备RP-HPLC分离酒糟中水溶性肽

色谱柱:Xbridge BEH C18反相色谱柱(10 mm×250 mm,5 μm);流动相:A超纯水(含体积分数0.1%的TFA)、B乙腈(含体积分数0.08%的TFA);洗脱程序:0~60 min,90%~40%A;60~70 min,40%~90%A;流速:2 mL/min;检测波长:214 nm;柱温:20 ℃;进样量:800 μL。

1.5 UPLC-Q-TOF-MS鉴定多肽氨基酸序列

将半制备分离后收集的各个组分分别旋蒸、冻干并复溶,待UPLC-Q-TOF-MS分析,利用质谱软件Biolynx解析鉴定。

色谱柱:BEH C18反相色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流动相:A 100%乙腈、B超纯水(0.1%甲酸);洗脱梯度:0~0.1 min,2%A;0.1~8 min,2%~40%A;8~10 min,40%~80%A;10~12 min,80%~100%A;12~12.1 min,100%~2%A;流速:0.3 mL/min;检测波长:200~500 nm;柱温:45 ℃;进样量:5 μL。

质谱条件:离子源:电喷雾源(electrospray ionization,ESI);毛细管电压:3 500 V;锥孔电压:20 V;模式:正负离子双模式;离子源温度:100 ℃;脱溶剂气温度:400 ℃;碰撞池电压:6V;离子扫描范围:m/z20~2 000。

2 结果与分析

2.1 半制备RP-HPLC分离酒糟中水溶性肽

RP-HPLC能根据溶质的极性大小使其达到分离的效果。实验选用波长214 nm表征多肽的分离效果。根据图1的紫外吸收情况,把R溶液共分为12个组分。

图1 酒糟样品在214 nm处的反相制备色谱图Fig.1 Semi-preparative RP-HPLC separation of distilled spent grains at 214 nm

2.2 UPLC-Q-TOF-MS鉴定多肽的氨基酸序列

在分析未知物结构时,无法预知它是否适合于正离子或负离子电离,在这种情况下,进行正离子和负离子分析是特别有用的[14]。本研究分别采用正离子[M+H]+和负离子[M-H]-两种模式,通过对比正负离子模式在同一保留时间下的质谱图,判断母离子m/z的大小。

以组分F3在1.055 min处的质谱图为例进行多肽结构分析。从RT 1.055 min时的负离子质谱图(图2-a)可看出,图中存在2个负离子峰[M-H]-,m/z分别为267.3和282.1,而在相对应的正离子质谱(图2-b)上只出现1个分子离子峰[M-H]-=269.3。电喷雾离子源可能使样品基质与溶剂生成加合物,故推测m/z282.1为溶剂峰,m/z267.3为多肽峰。

a-组分F3的负离子质谱图;b-组分F3的正离子质谱图图2 组分F3在1.055 min时离子质谱图Fig.2 Ion mass spectrum of fraction F3 at 1.055 min

绝大多数碎片离子是由多肽中相邻氨基酸间酰胺键(—CO—NH—)断裂产生的。Biolynx解析软件可以根据肽的分子离子峰计算出肽的质量数,且能在对应的质谱图上匹配多肽碎片离子。根据序列匹配度,预测出氨基酸序列。在正离子质谱中分子离子m/z269.3的分析结果如下:

其中,A、B、C为肽键的氨基端(N端)产生的离子,X、Y、Z则为羧基端(C端)生成的碎片离子,I为亮氨酸和组氨酸的亚胺离子,有下划线的数值为质谱中出现的碎片离子的质荷比m/z(部分质荷比数值由于相对丰度较低未在质谱图上显示)。低能碰撞主要产生B和Y离子。质谱图中出现了多肽Leu-His的碎片离子和组氨酸的亚胺离子,该多肽序列的匹配度为99.84%。

将多肽标准品Leu-His按照1.5中所述方法鉴定,发现Leu-His的保留时间与样品一致,出峰时间都在1.05 min,且标品Leu-His的分子离子和碎片离子(见图3)与样品在该保留时间下的质谱图吻合,进一步证明了酒糟中存在多肽Leu-His。

图3 多肽Leu-His的标准质谱图Fig.3 Standard mass spectrum of Leu-His

本实验中多肽鉴定的标准(置信度)设定为75%~100%。前3个组分F1、F2和F3中共鉴定出30种多肽的序列(包括2个相同序列的多肽)(表1),其中组分F1共鉴定出5种多肽,F2鉴定出16种,F3鉴定出10种,但F4~F12组分中并未检测到多肽。推测酒糟中水溶性肽的极性较大,在前3个组分中就已完全从反相柱中流出,即从F4至余下的半制备组分中不存在多肽。

组分F1和F2中RT 1.224 min处的MS图相同,根据选定母离子m/z386.3,鉴定为Ala-Ala-Pro-Lys即AAPK。该多肽可能在半制备组分F1和F2收集切换的8.60 min附近出峰。

2.3 酒糟多肽生物活性

酒糟中鉴定出30种多肽与文献比对,发现其中9种肽VPSGK、LH、HP、AAPK、KAGP、TVPK、YE、VPGK、TPF有生物活性,其中6种多肽AAPK[15]、KAGP[16]、TVPK[17]、YE[18]、VPGK[17]、TPF[19]与文献中的多肽完全或部分匹配,且均具有ACE抑制作用,另外AGP具有抗癌作用[20];2种多肽VPSGK[21]、LH[22]为抗氧化肽;1种短肽HP[23]具有抑制紫外线引起的红斑的功能。另外,抗氧化肽LH和ACE抑制肽YE也具有抑制紫外线引起的红斑的功能。

表1 酒糟中鉴定出的水溶性多肽Table 1 Water-soluble peptides identified in distilled spent grains

到目前为止,在清酒糟中鉴定出6种具有ACE抑制活性的功能性多肽RF、VW、VWY、YW、FMN、IYPRY[3-4];而我国浓香型酒糟中共鉴定出9种功能性多肽。除了与清酒糟中多肽具有相同的ACE抑制活性之外,部分肽还具有抗氧化等功能,说明了白酒糟中多肽功能的多样性。

研究人员根据DDBJ数据库氨基酸序列检索结果发现:清酒糟多肽与大米蛋白有相同的序列[24]。在美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)数据库中检索本研究中白酒糟多肽的氨基酸序列,发现了与谷蛋白、醇溶谷蛋白等高粱蛋白一致的序列。推测浓香型白酒酒糟中多肽来源于高粱蛋白。通过大曲与环境微生物如酵母等的代谢活动,高粱蛋白被分解形成功能性肽。由于肽的沸点较高,难以在白酒蒸馏过程中蒸馏出来而残留在酒糟中。

3 结论

本研究在浓香型白酒酒糟中鉴定出30种水溶性多肽,包括6种血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽AAPK、KAGP、TVPK、YE、VPGK、TPF,2种抗氧化肽VPSGK、LH和1种抑制紫外线引起的红斑的功能短肽HP。由于多肽合成周期较长,接下来的工作将围绕多肽的验证进一步合成余下的20多种多肽,并开始进行酒糟中多肽的定量工作。研究结果表明,白酒酒糟能富集更多的生物活性肽,这将为我国白酒酒糟深加工或高附加值利用提供理论基础。

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