喉痹中药组方规律探索及整合药理学分子机制*

杨相立，韦升利，王林，董林毅，赵振营，刘吉祥

(1.天津市人民医院耳鼻喉科，天津 300121；2.天津医科大学药学院，天津 300070；3.天津市人民医院药学部，天津 300121)

中医概念的喉痹在广义上是咽喉病的总称，在狭义上专指咽炎。喉痹的产生原因以肺胃为主，与五脏六腑有关；热邪火邪侵害为主，阴虚血虚为次。现代医学认为的咽喉疾病是以喉部肿胀疼痛呼吸闭阻不适为主要表现，通常认为口腔咽喉部位存在着各种致病菌，例如有溶血性链球菌等，与体内的其他微生物群落形成动态平衡。随着人体内部小环境改变，例如身体对疾病的抵抗能力下降、因各种原因过多过度用嗓时，原有的微生物群落的天然平衡就会出现混乱，有害的致病菌快速大量地异常繁殖造成严重感染。从而在咽喉或邻近部位出现典型的干、痛、肿等症状，广泛炎症容易出现在咽部黏膜、黏膜下组织及淋巴组织等部位。中西医对咽喉疾病的病因认知的迥异导致采取的治疗方式的不同，临床治愈率存在差异。笔者运用中医方剂数据挖掘软件研究喉痹中药组方的规律，并通过整合药理学平台建立咽喉疾病分子机制层面的传统中医与现代医学之间的过渡桥梁，深化了中西医在咽喉疾病领域的探索和认知，以进一步提高临床咽喉疾病的治愈率。

1 数据与方法

1.1数据来源

1.1.1处方来源与筛选 《中药成方制剂》是中药成方制剂的国家标准，将4000余种中成药汇编成21册，来源可靠明确、质量和安全有确切保障，具有较高的代表性和权威性，因而本研究将其所收集的组方作为数据分析来源。喉痹主要症状以中医病证诊断疗效标准为评判标准[1]。经软件分析后，符合条件的治疗喉痹处方组成共177 首。本研究所用的组方分析的“中医传承辅助系统(V2.5)”工具，开发商是中国中医科学院中药研究所。将筛选后的处方标准化导入辅助系统，数据的准确性由双人负责审核。

1.1.2数据分析 在中医传承辅助系统《中药成方制剂》数据库中提取出“中医疾病”以“喉痹”为关键字的相关的全部方剂。依据降序排列的顺序将方剂中组成中药进行频次排序，并导出结果。

1.1.3组方规律分析 将“支持度个数”定义为在所有药物中同时出现的次数，按照经验及分析需要设为17，“置信度”设为0.6，按药物组合出现频次降序顺序进行排序“规则分析”分析所得的规则。

1.1.4新方分析 选择合适的相关度和惩罚度，运用改进的互信息法和复杂系统熵聚类等核心算法进行聚类分析，运用无监督的熵层次的聚类的基本算法进行提取组合后发现新组方，通过网络可视化直观展示。

1.1.5化学成分来源 在整合药理学平台信息设定页面，以中医传承平台筛选出的新方中药组成，建立化学成分库。

1.1.6候选靶标来源 在整合药理学平台的信息设定界面，以“Iaryngopharyngitis”作为疾病或症状关键词进行检索，手工建立DRUGBANK对应的疾病靶标。在中药靶标预测界面导入所获得的化学成分库，候选成分预测靶标要求相似性分数>0.9。

1.2方法

1.2.1中医传承辅助系统 本软件开发商是中国中医科学院中药研究所，在软件中采用了先进的数据挖掘方法，例如：规则分析、改进的互信息法、复杂系统熵聚类、无监督的熵层次聚类等，具有一体化的“录入-管理-查询-分析-网络可视化展示”等数据处理能力，一站式完成病案、疾病、证候、中药、方剂、四诊等信息的管理、查询、综合分析等功能，主要用于方剂组方规律分析及新药处方发现等研究[2]。

1.2.2整合药理学平台 整合平台以多学科边缘交叉、融合为基础，以大数据库为依托，采用人工智能、数据挖掘、网络计算科学等方法和技术，运用系统工程的方法[3]，融合“整体与局部”“体内药物动力学过程与活性评价”“体外与体内”等多层次、多环节的综合性研究，构造了传统中医与现代科技之间过渡桥梁[4]。

1.3数据分析

1.3.1喉痹治疗方剂用药规律分析 对于已建立的喉痹中医方剂库，通过集成规则分析、互信息法等数据挖掘方法，相继开展了频次统计分析、组方规律分析和新方分析等深入计算，筛选出合适的新方。

1.3.2核心组合对分子机制研究 应用整合药理学平台靶标预测、网络构建等功能，进行分析及可视化工作。构建筛选新方的成分-靶标网络，及新方-喉痹相关靶标网络，并对筛选新方所作用的喉痹相关靶标进行功能分析及通路分析对比。

1.3.3新方确定 排除程序筛选出的有毒中药和临床不常用的中药，确定合适的新方。

2 结果与分析

2.1用药频次统计 对方剂数据库治疗喉痹的处方中的药物频次进行处理，发现使用频次高于20的共有17 味药，位居使用频次前5 位的分别是甘草、冰片、黄芩、大黄、玄参。在高频药物中，甘草补脾益气，清热解毒。冰片味辛苦，性温无毒，主治喉闭乳蛾。黄芩味苦平，大寒无毒，主治诸热，可以针对胃热导致的咽喉肿痛。大黄味苦寒，除痰实，涤荡肠胃间热，适用于痰、肠热导致的咽喉肿痛。玄参味苦咸，主腹中寒热积聚。见表1。

表1使用频次>20次的中草药情况

Tab.1Chineseherbswithusagefrequencymorethan20

中药名称频率甘草54冰片52黄芩47大黄35玄参35薄荷31桔梗31牛黄31麦冬29金银花29中药名称频率连翘25栀子25板蓝根23生地黄23青黛21珍珠20硼砂20

2.2组方规律分析 分析所得药对及药组的用药规则，按照药物组合出现频次由高到低排序，前5位分别是“黄芩，大黄”(27)、“冰片，牛黄”(27)、“甘草，薄荷”(25)、“玄参，甘草”(24)、“麦冬，玄参”(24)。 “黄芩，大黄”合用可运用大黄苦寒走里，通便泻热以解毒，热从下泻，黄芩苦寒走表，清表泻火。二药合用，相辅相成，表里双解，实热自除；“冰片，牛黄”合用既可清热泻火、止痛的功效；“甘草，薄荷” 合用可发汗解表，散热疏风；“玄参，甘草”合用可生津滋阴、止咳发热；“麦冬，玄参”合用可利咽滋阴、止渴润燥。高频出现的药对具有缓解喉痹的临床症状的作用，对发热、上火、疼痛的喉痹症状等均有明确的疗效。见表2。

表2处方中支持度为70%条件下中草药组合频次

Tab.2Chineseherbcombinationfrequencyinprescriptionswithsupportdegreeof70%

序号药物模式出现频度1黄芩,栀子182黄芩,甘草203黄芩,大黄274黄芩,桔梗195栀子,甘草176玄参,甘草247麦冬,玄参248生地黄,玄参209甘草,薄荷2510甘草,大黄19序号药物模式出现频度11甘草,桔梗1912冰片,甘草2313麦冬,甘草1814生地黄,甘草1915冰片,青黛1816冰片,珍珠1817冰片,牛黄2718麦冬,生地黄1719麦冬,玄参,甘草1720麦冬,生地黄,玄参17

2.3新方分析 运用进行药物间的关联度分析，结合基于无监督熵层次聚类和基于熵层次聚类等算法，获得治疗喉痹5个新处方(表3)。通过 “网络展示功能”直观地展示出药物不同组合之间的关系，得到治疗喉痹新处方的网络可视化展示(图1)。排除新方组成筛选出的矿物类、毒性类中药雄黄、蟾酥以及不常用的中药，以及考虑与整合药理学平台联用的一致性，通过中医传承辅助系统挖掘得到的合适的新方组成为“麦冬_生地黄_川贝母_牡丹皮_栀子_黄芩_黄柏_大黄”。新方组成中，麦冬生津解渴、润肺止咳；生地黄清热凉血、养阴生津；川贝母润肺化痰；牡丹皮清热凉血、消炎镇痛、活血化瘀；栀子泻火除烦、清热利湿、清肝明目、消肿止痛；黄芩清热燥湿、泻火解毒；黄柏清热燥湿、泻火解毒；大黄利湿退黄、泻热通便。

表3基于熵层次聚类的治疗喉痹新处方

Tab.3Newprescriptionsforpharyngitistreatmentbasedonhierarchicalclusteringentropy

序列号新方组合0滑石-羌活-牵牛子-千里光-决明子1珍珠-青黛-冰片-雄黄-麝香-蟾酥2青黛-硼砂-冰片-珍珠-牛黄-蟾酥3野菊花-岗梅-鱼腥草-山芝麻-金盏银盘4麦冬-生地黄-川贝母-牡丹皮-栀子-黄芩-黄柏-大黄

2.4整合药理学平台分析

2.4.1化学成分统计分析 新方中麦冬共收集化学成分53个，主要化学成分为含多种甾体皂苷，如麦门冬皂苷；含黄酮类多为髙异黄酮类；含挥发油、微量元素、谷甾醇、豆甾醇等[5]。生地黄共收集化学成分38个，主要化学成分为糠醛、酪醇、紫罗兰酮、阿魏酰基筋骨草醇、麦角甾苷、地黄苷、异地黄苷等[6]。川贝母共收集化学成分21个，主要化学成分为异甾类生物碱和生物碱，生物碱成分有川贝碱、西贝素[7]。牡丹皮共收集化学成分15个，主要化学成分单萜及其苷类、酚及酚苷类、三萜及其苷类和挥发油类等成分[8]。栀子共收集化学成分48个，主要化学成分为环烯醚萜类化合物，同时还存在有机酸、黄酮、香豆素、挥发油、皂苷、木脂素、多糖及其他类化合物等[9]。黄芩共收集化学成分54个，主要化学成分为黄酮及其苷类、萜类化合物及挥发油等成分等[10]。黄柏共收集化学成分24个，主要化学成分为含有生物碱类、柠檬苷素类、留醇类、酯类、萜类、挥发性成分类及微量元素类等有效成分，特征化学成分为盐酸小檗碱[11]。大黄共收集化学成分88个，主要化学成分有蒽醌及其苷类、蒽酮及其苷类、二苯乙烯类、多糖类、鞣质类等[12]。

图1 治疗喉痹新处方( 相关度5，惩罚系数2)

2.4.2新方组合对治疗喉痹的核心靶标网络分析 通过整合药理学平台可获得新方靶标功能基因本体(gene ontology，GO)富集分析和通路KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信号通路富集分析，以及分别构建基于蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)数据库的新方组合核心对作用的潜在靶标与疾病靶标之间相互作用网络。系统设定根据Degree值，图2仅显示前100个靶点，图中节点大小与Degree值正相关。在整合药理学平台上可获得新方靶标功能GO富集分析和通路KEGG富集分析，同时构建基于PPI相互作用数据库的新方组合核心对作用的潜在靶标与疾病靶标之间相互作用网络。根据条件筛选出新方组合关键靶标630个，其中化学成分潜在作用节点358个，没有直接作用的节点，表明新方的化学成分是通过间接影响发挥的作用。

2.4.3通路富集分析 运用平台的网络构建与分析功能进行新方中心蛋白质(Hub)节点及其通路、功能富集分析、通路富集分析并进行对比。见表4，5。

图2新方中药方剂调节疾病失衡网络的候选靶标网络

Fig.2CandidatetargetnetworkforregulatingdiseaseimbalancenetworkbynewprescriptionoftraditionalChineseMedicine

表4 新方治疗疾病关键靶标具有的功能信息列表对比

表5 新方治疗疾病关键靶标所参与的通路信息列表对比

2.4.4靶标分析 运用平台的关键靶标分析功能分别进行新方核心靶标网络可视化分析、关键靶标功能富集分析、关键靶标的通路富集分析、中药-成分-关键药靶-通路网络可视化分析。见图3。

图3新方中药方剂治疗疾病“核心成分-关键靶标-主要通路”多维网络关系图

Fig.3Multi-dimensionalnetworkdiagramof"corecomponent-keytargets-mainpathways"ofthenewprescriptionsfordiseasetreatment

3 讨论

药物靶标与疾病靶标基因功能及KEGG通路富集分析显示，新方在GO基因功能包括细胞外谷氨酸门控离子通道活动、离子型谷氨酸受体信号通路、谷氨酸受体信号通路、谷氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA) 受体活性、NMDA选择性受体复合物、海人酸选择性谷氨酸受体活性、用于蛋白质翻译的转运核糖核酸(Transfer ribonucleic acid，tRNA)氨酰化、突触后膜、化学突触传递、甘氨酸结合、氨基酸跨膜转运蛋白活性、线粒体基质、细胞连接处、尿素循环、离子跨膜运输、tRNA结合、氨基酸结合、突触传递，甘氨酸能、兴奋性突触后电位等多个条目。药物靶标-疾病靶标进行基因功能分析结果表明，新方可能的靶标基因与氨基酸的生物合成、氨基酸代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、其他氨基酸的代谢、谷氨酸能突触、氨酰-tRNA的生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、神经系统、神经活性配体-受体相互作用、信号分子和相互作用等多个条目有关。新方在GO基因功能和基因功能分析结果显示，与氨基酸代谢特别是谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、脯氨酸等代谢密切相关。有研究指出，咽部是人体重要的储菌库，所以咽部细菌的分布可能与慢性咽炎发病原因与机制存在一定的关系，溶血性链球菌、肺炎双球菌、流行性感冒杆菌及病毒等病原微生物的异常增加导致菌群的平衡失调[13]。推测新方的中药成分有可能通过影响人体的氨基酸代谢从而对咽喉部位的菌群环境形成了有效的调节作用，从而间接提高对咽喉疾病的治疗效果。

结合网络关键靶标功能富集分析、关键靶标的通路富集分析、中药-成分-关键药靶-通路网络可视化分析的结果，可以发现图中新方化学成分对于喉痹的干预主要集中在氨基酸代谢相关通路的靶标上。查阅相关文献发现，目前对于西医对于咽喉疾病的干预机制研究多集中于直接的抗菌抗病毒方面[14]，中医对于喉痹的机制多处于对证施治方面，在分子机制有关方面的研究较少。依据中医经络循行理论，咽喉是经脉循行交会之处，在十二经脉中，除手厥阴心包经和足太阳膀胱经间接通于咽喉外，其他经脉直接通达。在中医治疗中，刺激大肠经和小肠经穴位可以治疗咽喉炎症。大肠经内属于大肠，小肠经内属于小肠，表明在肠道和咽喉之间存在密切的经络关联，可以通过刺激调整肠道来治疗咽喉疾病。邓燕飞[15]在研究慢性咽喉炎与胃肠道疾病的相关性时注意到治疗消化道疾病的同时咽喉疾病也有所改善的特点。张莉[16]研究上呼吸道微生态平衡研究与益生菌制剂的关系，提出慢性咽炎通过类似肠道微生态制剂的方式进行微生态平衡研究的设想。余鸿亮[17]运用微生态制剂整肠生对慢性咽炎患者进行混悬液含漱和口服整肠生胶囊，取得显著治疗效果。以上研究证实运用肠道微生态制剂治疗咽喉疾病的可行性。欧阳万金等[18]研究谷氨酰胺对动物肠道微生态的积极影响。同时肠道菌群能利用蛋白质残渣合成非必需氨基酸，如天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸和苏氨酸等。结合中医刺激大肠经和小肠经穴位治疗咽喉炎症的实践，西医运用氨基酸代谢平衡菌群微生态以及对肠道微生态制剂治疗咽喉疾病的研究，而进一步证实了本研究所推测的中药新方通过氨基酸代谢通路干预微生物菌群的平衡从而治疗喉痹的结论。

咽喉疾病作为常见病高发病，西医对外部的微生物影响因素研究较多，但是缺乏特异性的治疗措施，目前临床上主要治疗措施是使用抗菌药物和抗病毒药物，无法应对致病菌的多样性和用药单一混乱的耐药性问题，容易使得患者病情反复难以痊愈，同时长期大量使用抗菌药物、激素会对患者健康产生不利影响[19]。笔者通过中医传承辅助平台，挖掘并分析经典名方新方，经过分子机制关联进行深入分析，发现存在与氨基酸代谢通路的关联性，并且形成了中药组方通过氨基酸代谢通道影响咽喉部微生物群落平衡的观点，在诸多的研究中得到了一定程度的证实。这为下一步的深入研究提供方向性的启示。目前这方面的文献报道还不充分，还有待于更多的深入研究工作提供数据支持。本研究仅是基于现有研究结果的一个预测，具体的机制还需要具体的实验进行验证。