榄香烯乳对宫颈癌HeLa细胞的放射增敏作用

曾春生 曾红学 黄作超 等

[摘要]目的 探究榄香烯乳对宫颈癌HeLa细胞的放射增敏作用，为其在宫颈癌放射治疗中的临床应用提供依据。方法 将榄香烯乳未处理组作为对照组，榄香烯乳处理组作为治疗组。通过克隆形成实验、流式细胞仪检测HeLa细胞增殖、凋亡能力及细胞周期分布、细胞免疫荧光检测Bax及Bcl-2蛋白的表达;制备裸鼠HeLa细胞种植瘤模型，给予榄香烯乳及不同剂量射线照射后，计算种植瘤的体重及体积变化，分析榄香烯乳对HeLa细胞放射增敏作用。结果 当榄香烯乳浓度≥40 μg/ml时，能显著抑制HeLa细胞增殖及促进细胞凋亡，并通过促进Bax表达，抑制Bcl-2表达参与细胞凋亡调节。不同放射剂量射线下，治疗组HeLa细胞或种植瘤均较对照组生长抑制明显。结论 榄香烯乳能显著提高HeLa细胞的放射敏感性。

[关键词]宫颈癌;HeLa细胞;榄香烯乳;放射增敏

[中图分类号] R737.33          [文献标识码] A          [文章編号] 1674-4721（2019）2（a）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of elemene on radiosensitization of cervical cancer HeLa cells and provide evidence for its clinical application in radiotherapy of cervical cancer. Methods The untreated group of elemene was the control group， and the elemene treatment group was the treatment group. The proliferation， apoptosis and cell cycle distribution of HeLa cells were detected by colony formation assay and flow cytometry. The expression of Bax and Bcl-2 protein was detected by immunofluorescence. The implanted tumor model of HeLa cells in nude mice was used to give elemene emulsion and after different doses of radiation， the body weight and volume changes of implanted tumors were calculated， and the radiosensitizing effect of elemene emulsion on HeLa cells was analyzed. Results When the concentration of elemene was ≥40 μg/ml， it could significantly inhibit the proliferation of HeLa cells and promote apoptosis， and promote the regulation of Bax expression and inhibit the expression of Bcl-2. Under different radiation doses， HeLa cells or implanted tumors in the treatment group were significantly inhibited by growth inhibition compared with the control group. Conclusions Elemene can significantly increase the radiosensitivity of HeLa cells.

[Key words] Cervical cancer; HeLa cells; Elemene; Radiosensitization

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年大约有50万新发病例，80%的新发病例在发展中国家[1]。我国是宫颈癌高发国之一，患病率和死亡率均约占全世界1/3[2]。近年来宫颈癌的发病率有上升趋势，尤其在年轻女性宫颈癌发病率逐年提高，且中、晚期患者较多，预后不佳[3]。宫颈癌的主要治疗手段为放疗、手术，手术为主的综合治疗仅限于Ⅱa期以早的病例，宫颈癌一般发现时分期较晚，丧失了最佳手术治疗的机会，因此放疗在宫颈癌的治疗中起着十分重要的作用[4-6]。

提高肿瘤细胞对放射线的敏感性，在适当降低放疗总剂量的同时，提高肿瘤治愈率及减少并发症、后遗症，一直是临床研究的重点。近年来，榄香烯抗肿瘤方面的作用得到较多关注，但一般作为化疗辅助药物[7-9]，放疗增敏的研究报道较少。本文通过榄香烯乳对宫颈癌HeLa细胞和裸鼠移植瘤的放射增敏作用的研究，为其在宫颈癌放射治疗中的临床应用提供依据，现报道如下。

1材料与方法

1.1实验材料

DMEM培养基（Gibco公司）、类胎牛血清（Hyclone公司）、100×青-链霉素（杭州昊天生物技术有限公司）;细胞凋亡试剂盒（联科生物公司）;DAPI（Sigma，D9452）、Bax antibody（Abcam，ab32503）、Bcl-2 antibody（Abcam，ab32124）、Alexa FluorR 488 Donkey anti-rabbit IgG （Life，1723019）、榄香烯注射液（大连华立金港药业有限公司，规格：20 ml∶0.1 g/支，批号：1508161，有效期至2018年7月）、戊巴比妥钠（SIGMA，140418）、Ⅸ 73型显微镜（OLYMPUS公司）、ECLIPSE Ti-S型倒置显微镜（Nikon公司）、Hela细胞（赫贝科技细胞库复苏）。

1.2实验方法

1.2.1克隆形成实验

1.2.1.1细胞增殖部分  取对数生长期的HeLa细胞接种于培养板，每孔500个细胞。加入含不同浓度（0、10、20、40、80、160 μg/ml）的榄香烯乳培养液培养。培养后培养板置于光镜下观察，计数>50个细胞数的集落数。按以下公式计算：药物作用后集落存活率=某一浓度药物组作用后集落数/该组细胞种植数。一共6组，每组3个重复，1个时间点。

1.2.1.2放射增敏部分  取对数生长期的HeLa细胞接种于培养板，每孔1000个细胞;加入或不加入40 μg/ml的榄香烯乳培养液培养;24 h贴壁后再用铱192核素进行辐射，分别辐射0、0.5、1、1.5、2 Gy。培养15 d后，将培养板置于光镜下观察，结晶紫染色，计数>50个细胞数的集落数。按以下公式计算：药物作用后集落存活率=某一浓度药物组作用后集落数/该组细胞种植数。一共6组，每组3个重复，1个时间点。

1.2.2细胞凋亡检测

取生长状态良好的HeLa细胞，铺6孔板，每孔加入1×105个细胞，放入培养箱中静置24 h。用40 μg/ml的榄香稀乳处理HeLa细胞，于24 h和48 h后收集细胞检测细胞凋亡。药物作用后，离心收集细胞，PBS洗涤细胞两次，用500 μl 1×Binding Buffer悬浮细胞，在细胞悬浮液中加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI，轻轻混匀后于4℃避光条件下孵育5 min，上流式细胞仪检测。

1.2.3细胞免疫荧光检测

取对数生长期的HeLa细胞，以每孔5×104个细胞种植至24孔板，放入培养箱中培养，待细胞贴壁。①对照1组：不做任何处理，正常培养。②24 h培养组：加入40 μg/ml的榄香烯乳培养液培养24 h。③48 h培养组：加入40 μg/ml的榄香烯乳培养液培养48 h。各组细胞，PBS洗3次，4%多聚甲醛室温固定30 min;PBS洗3次，0.5%的Triton室温破膜20 min;PBS洗3次，5%的BSA室温封闭1 h;PBS洗3次，分别加入相应一抗，4℃过夜;PBS洗3次，分别加入相应荧光二抗，室温避光孵育1 h;PBS洗3次，加入10 nm浓度的DAPI染料，室温避光孵育5 min;PBS洗3次。在200倍荧光显微镜下，观察蛋白荧光强度。

1.2.4实验动物及饲养条件

实验动物：30只4～5周龄裸鼠由上海莱克斯实验动物有限责任提供，接收时动物体重为16～18 g，生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002，合格证号：0278762，SPF级。饲养环境：温度范围20～25℃，相对湿度范围40%～70%。

1.2.5荷瘤的小鼠制备及其处理方法

取对数生长期HeLa细胞，调整细胞浓度至2×106/ml，以1 ml空针将细胞悬液吹打混匀后，取0.2 ml接种于裸鼠右侧腹股沟皮下，含细胞数4×105个/只。观察接种部位液体吸收、肿瘤生长过程及裸鼠状况，待肿瘤生长至直径>1 cm时，30只荷瘤裸鼠按肿瘤体积随机分为两组，即：治疗组和对照2组，每组各15只。治疗组腹腔内注射榄香烯，剂量为100 mg/kg，对照组给予0.2 ml生理盐水。两组动物分别于1、4、7、10、13、16、19、22 d给药，每次给药前称量鼠重，调整给药剂量，同时测量肿瘤体积，并分别于第4、7、10、13、16、19、22 d给药后2 h进行放疗，条件为：裸鼠仰卧位固定，腹股沟部照射野大小为2 cm×3 cm（根据肿瘤大小进行调整），肿瘤表面覆盖厚填充物，铱192核素照射，照射剂量为DT 2 Gy/F，3 min。

1.2.6检测指标

各组裸鼠于给药后第3天称重并测量瘤块体积，1次/3 d，用游标卡尺测量瘤体的最长径（a）和最短径（b），计算肿瘤体积（V），单位cm3，V=1/2 ab2=0.5 ab2，绘制肿瘤生长曲线。动物体重：每3天测量1次动物总重，动物体重=总重-肿瘤体积（假设肿瘤密度为1）。处死动物，分别称体重和瘤重，计算：瘤体积抑制率=（1-试验组平均瘤体积/对照组平均瘤体积）×100%;瘤重抑制率=（1-试验组平均瘤重/对照组平均瘤重）×100%，停止照射后3 d，处死裸鼠，剥离肿瘤，部分-80℃保存，部分4%甲醛固定，用于后续检测。

1.3统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验;采用Graph Pad Prism统计软件进行多组均数分析，先对数据进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析进行总体比较，用多个剂量组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据改用秩和检验进行统计;计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1榄香烯乳对HeLa细胞增殖能力的影响

2.2榄香烯乳对HeLa细胞周期及凋亡的影响

通过流式细胞仪检测细胞周期及凋亡，分析发现榄香烯可改变HeLa细胞周期的分布，当40 μg/ml榄香烯处理48 h后，G2/M期细胞比例低于处理0 h，凋亡率高于处理0 h;处理24 h后，G1期细胞比例高于处理0 h，S期细胞比例低于处理0 h;处理48 h后，G1期细胞比例低于处理0 h，S期细胞比例高于处理0 h，差异有统计学意义（P<0.05），提示榄香烯可使Hela细胞周期阻滞于S期，阻断细胞由S期向G2/M期的进程，阻滞细胞的有丝分裂，使细胞发生S期阻滞，促使HeLa细胞凋亡（表1）。

2.3欖香稀乳对HeLa细胞Bcl-2和BAX表达的影响