寨卡病毒NS1蛋白的原核表达和单克隆抗体的制备

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寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)是一种新发的虫媒传播病毒，属于黄病毒属成员，其基因组编码3种结构蛋白(Capsid, prM/M, E)和7种非结构蛋白(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5)。ZIKV主要通过伊蚊主要是埃及伊蚊和白纹伊蚊叮咬传播，也可通过母婴传播、血液传播和性传播[1]。2007年在西太平洋密克罗尼西亚的雅浦(Yap)岛上发生了第一次ZIKV感染疫情[2]，2013年10月，在法属波利尼西亚发生了大规模疫情[2-3]，之后，ZIKV在世界范围内迅速蔓延，并在2015年，巴西的ZIKV感染已经达到了大规模流行的水平。ZIKV感染后80%的成年人几乎没有任何明显症状，20%的成年患者有轻微的症状，通常表现为发热、黄斑皮疹、关节痛、结膜炎、头痛等[2]。但是，孕期感染ZIKV的母亲产下的孩子会有小头畸形[4]，此外，在ZIKV非常流行的哥伦比亚发现了大量的格林-巴利综合征的患者[5]，这意味着ZIKV和这些神经障碍之间有很强的联系。ZIKV感染已成为热带和亚热带地区的一个主要公共卫生问题，2016年起，ZIKV的流行已被世界卫生组织列为国际公共卫生紧急事件[6]。

目前没有任何针对ZIKV感染的抗病毒药物，预防感染的疫苗仍在临床试验阶段[7]，因此，病毒感染的早期诊断在患者治疗中显得尤为重要。在常规的诊断方法中，使用RT-PCR、Real-time RT-PCR检测病毒核酸具有较高的灵敏度和特异性，但是需要专门的实验设备和经验丰富的技术人员，并且由于核酸提取过程容易受酚类、盐和乙醇等化学试剂残留等影响而容易出现假阴性结果，实验室内部核酸交叉污染也容易导致假阳性问题。联合两种或两种以上的检测方法对ZIKV感染的诊断更为准确，因此，发展ZIKV血清学检测手段具有重要的意义。在使用RT-PCR方法检测雅浦ZIKV感染病人血清的同时，Robert S. Lanciotti 等人分别使用ZIKV、登革热病毒(DENV)1-4型、黄热病病毒(YFV)、日本脑炎病毒(JEV)和墨累河谷脑炎病毒(MVEV)抗原包被捕获血清IgM的ELISA方法检测病人血清，发现ZIKV感染的病人血清IgM与登革病毒、日本脑炎病毒和黄热病毒的抗原有交叉反应，这种交叉反应在第一次被黄病毒感染的病人中出现的机会较小，而在第二次被黄病毒感染的病人中出现的机会很大[8]。这种与其他黄病毒间的交叉反应性增加了使用ELISA法诊断ZIKV感染的难度，目前为止仍没有开发出针对ZIKV的ELISA检测试剂盒。

黄病毒NS1蛋白是7种非结构蛋白中唯一能分泌到感染病人血清中的非结构蛋白[9-10]，在病毒感染细胞后，NS1能够以可溶的六聚体形式分泌出细胞外，在病毒感染早期即能够在血清中检测到NS1，因此，NS1可作为临床快速诊断病毒早期感染的标志。已有研究显示NS1蛋白中携带有较多的特异性表位，可以诱导出多个在黄病毒属病毒中无交叉反应的特异性抗体[11]。本研究拟通过构建寨卡病毒NS1蛋白重组表达质粒、表达与纯化NS1蛋白、小鼠免疫、细胞融合和抗体筛选等步骤制备针对寨卡病毒NS1蛋白的单克隆抗体，为后续建立针对NS1蛋白的ELISA检测方法及相关研究提供基础。

1 材料与方法

1.1质粒和菌株、实验动物和主要试剂 原核表达质粒pET-32a、ER2566菌株以及HB101菌株由本实验室保存。BALB/C小鼠购自斯莱克景达实验动物有限公司。GAM-IgG-HRP由厦门大学夏宁邵教授惠赠；限制性内切酶XhoI、XbaI以及DNA相对分子质量标准购自TaKaRa公司；抗His-tag鼠单克隆抗体、Ni-IDA Resin、质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒购自上海生工公司；HT、HAT以及弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂，购自Sigma公司；DMEM培养基购自GIBCO公司；胎牛血清购自天杭生物科技有限公司；HRP-DAB底物显色试剂盒购自天能科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒，购自碧云天生物技术有限公司。

1.2重组质粒的构建与鉴定 以研究较多的2007年雅浦岛Zika流行株(GenBank No. AY632535)序列为模板，商业合成NS1基因序列，使用PCR的方法在NS1的N端引入6×His标签。将ZIKV的NS1片段与表达载体pET32a经XhoI/XbaI双酶切后，16 ℃连接1 h，转化至大肠杆菌HB101中，挑取单菌落进行鉴定，将鉴定正确的质粒转化至大肠杆菌表达菌ER2566中，挑取单菌落接种至3 mL LB液体培养基中，待OD600nm至0.6～0.8时，加入浓度为200 μg/mL的IPTG，诱导重组蛋白的表达，离心收集菌体,制备蛋白质样品进行12%的SDS-PAGE电泳鉴定。

1.3ZIKV NS1蛋白的表达及纯化 将重组表达菌株接种到1 L LB液体培养基中，待菌液OD600nm至0.6～0.8时，加入浓度为200 μg/mL的IPTG，诱导后离心收菌并超声破碎，悬液、上清和沉淀分别取样，12%的SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达方式。用2%的TritonX-100 (buffer I) 和buffer I洗涤沉淀，然后用8 mol/L尿素溶液重悬，4 ℃梯度透析复性，当透析至2 mol/L Urea (PBS) 后，用镍柱亲和层析法对收集的蛋白进行纯化。分别用含2 mol/L尿素的不同浓度的咪唑进行梯度洗脱，分别收集流穿液和洗脱液，将洗脱液用1 mol/L Urea(PBS)、PBS梯度透析复性，12% SDS-PAGE 鉴定蛋白纯度。

以10倍柱床体积的磷酸Buffer预先平衡TSK-GEL G3000 SW分子筛层析柱至280 nm处的吸收值的波动小于0.001，把透析复性后的样品先用0.22 μm的滤膜过滤，接着以0.5 mL/min的流速过柱，收集280 nm处吸收值大于0.2 AU的蛋白峰。制备蛋白质样品进行12% SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。

将纯化后的重组NS1蛋白进行12%的SDS-PAGE电泳，300 mA恒流电转60 min，用5%的脱脂牛奶室温封闭2 h，以鼠源His-tag单抗作为一抗，4 ℃孵育过夜，以GAM-IgG-HRP作为二抗，室温孵育1 h，配制新鲜的ECL工作液，滴加到膜上后显影。

1.4小鼠免疫 将纯化后的蛋白按1∶1的比例与弗氏完全佐剂充分乳化后，皮下多点免疫6～8周龄的BALB/c小鼠，剂量为100 μg/只。两周后，与弗氏不完全佐剂充分乳化，然后以同样的剂量和方法对小鼠进行两次加强免疫，每次间隔两周。在细胞融合前3d，对小鼠进行脾脏加强免疫，剂量为100 μg/只。每次免疫前1d对小鼠进行眼球静脉取血，间接ELISA检测免疫小鼠效价。将纯化的NS1蛋白用蛋白包被液稀释至浓度为1 μg/mL后包被于聚苯乙烯板条上，ED封闭，用小鼠血清作为一抗，浓度从1∶100梯度稀释至1∶400 000，HRP标记羊抗鼠IgG(1∶10 000)作为二抗，TBST洗板，TMB底物显色，2 mol/L H2SO4终止显色反应，450 nm/630 nm双波长检测各孔的OD450nm值，将小鼠免疫前的血清作为阴性对照，以大于2.1倍阴性值作为阳性。

1.5细胞融合 脾脏免疫后3 d，取免疫小鼠的脾脏，收集脾细胞，再收集生长状态良好的SP2/6骨髓瘤细胞，将SP2/6与脾细胞按1∶5～1∶10进行混合，在37 ℃预热的聚乙二醇(PEG)1500作用下进行细胞融合，并用无血清DMEM培养基终止融合。用20% FBS-HAT-DMEM培养基悬浮细胞，然后均匀铺于96孔板中，在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

1.6杂交瘤细胞的筛选及克隆化 融合后的细胞在培养第7 d左右用10% FBS-HT-DMEM培养基半量换液，待细胞集落长至孔底面积的1/3～1/2时，取培养上清，用间接ELISA方法进行检测，以细胞培养上清作为一抗，选取OD450nm值较高且细胞集落数目少的孔，通过有限稀释法进行克隆化。进行3～4次克隆化，直至细胞培养上清阳性率达100%。取细胞上清作为一抗，分别以抗 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM的抗体作为二抗，使用间接ELISA法对单克隆抗体进行亚型鉴定。

1.7单克隆抗体的制备、纯化和鉴定 取8～10周龄的雄性BALB/c小鼠，按每只500 μL的剂量腹腔注射石蜡油。7 d后用PBS将杂交瘤细胞数调整为1×106～2×106个/mL，按每只500 μL的剂量腹腔注射小鼠。7～10 d后，收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵沉淀和Protein G柱进行纯化，将纯化前后的腹水抗体进行12% SDS-PAGE鉴定。将纯化后的重组NS1蛋白进行12% SDS-PAGE，以制备的单克隆抗体作为一抗，以GAM-IgG-HRP作为二抗，对单克隆抗体进行鉴定。

1.8单克隆抗体的效价测定 使用间接ELISA法测定抗体效价，用单克隆抗体作为一抗，浓度从1∶1 600梯度稀释至1∶1 280 000，将OD450nm值大于阴性对照2.1倍的检测孔的最低抗体浓度定为抗体效价。

2 结 果

2.1ZIKV NS1原核表达质粒的构建及重组NS1蛋白的表达与纯化 以化学合成的ZIKV(GenBank No. AY632535)序列为模板扩增NS1基因，通过XhoI/XbaI双酶切将NS1基因插入pET32a原核表达质粒中，将重组NS1-pET32a质粒转化至表达菌株，经IPTG诱导后，SDS-PAGE检测蛋白表达情况，结果显示：与对照组相比，诱导后的重组菌株表达了一个大小约30 kD的蛋白(图1A)。重组NS1蛋白含有358个氨基酸，大小约40 kD，为了验证诱导后表达蛋白是否为NS1蛋白，我们以抗His标签抗体作为一抗，使用Western blot对重组蛋白的表达情况进行鉴定，结果显示，在30 kD处经IPTG诱导的重组菌株出现了特异性条带，而对照菌株中没有出现(图1B)，说明表达菌株经IPTG诱导后所表达蛋白为带有His标签的NS1重组蛋白，重组蛋白电泳比预期分子量小，可能是由于蛋白电泳速率差异，或者是重组NS1在菌体中出现部分片段降解所导致的。超声破碎经IPTG诱导的重组表达菌株，SDS-PAGE结果显示，与其他黄病毒NS1蛋白原核表达一致[12]，ZIKV NS1蛋白也主要以包涵体的形式表达(图1C)。我们将包涵体用尿素溶解后透析复性，并经His-taq亲和层析纯化后，继续对其进行分子筛层析，并用Western Blot鉴定，结果显示：经分子筛层析纯化后的蛋白纯度高，达到免疫小鼠制备单克隆抗体的要求(图1D、E)。

(A)SDS-PAGE、(B)Western Blot鉴定重组NS1的表达(M：预染蛋白质相对分子质量标准；1：未加IPTG的对照菌株表达的蛋白；2：加IPTG诱导的重组菌株表达的蛋白)。(C)SDS-PAGE鉴定重组NS1的表达方式(M：预染蛋白质相对分子质量标准；1：超声破碎后悬液；2：离心后上清；3：离心后沉淀)。(D)SDS-PAGE鉴定分子筛纯化后的重组蛋白纯度(M：预染蛋白质相对分子质量标准；1：分子筛纯化后的重组NS1蛋白)。(E)Western Blot鉴定分子筛纯化后的重组蛋白纯度。黑色箭头所指为目的蛋白。

2.2间接ELISA检测免疫小鼠的效价 以纯化后的NS1蛋白作为抗原免疫小鼠，使用间接ELISA法检测血清中抗体效价，结果显示：小鼠在初次免疫后抗体水平较低，在第2次和第3次加强免疫以后，小鼠血清抗体含量明显升高，效价可达1∶100 000 (图2)，说明重组NS1蛋白在小鼠体内能引起较强的免疫反应，其作为抗原具有良好的免疫原性，3次免疫后血清效价达到制备单克隆抗体的要求。

图2 间接 ELISA 检测小鼠血清抗体效价Fig.2 Antibody titers of mice sera detected by indirect ELISA

2.3细胞融合、抗重组NS1单克隆抗体的筛选及亚型鉴定 将小鼠脾细胞取出与骨髓瘤细胞进行融合，用间接ELISA方法进行阳性克隆的检测，然后通过有限稀释法对OD450nm值较高且细胞集落数目少的孔进行克隆化(图3)，通过4次克隆化，筛选出了3株选能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为6B8、7D11、3E2。将杂交瘤细胞的培养上清进行亚型鉴定，结果显示：6B8、7D11、3E2亚型均为IgG1型。

图3 单克隆抗体的亚型鉴定Fig.3 Subtype identification of anti-NS1 monoclonal antibodies

2.4单克隆抗体的纯化与鉴定 收集注射杂交瘤细胞的小鼠腹水，使用辛酸-饱和硫酸铵沉淀和Protein G柱纯化单克隆抗体，将纯化前后的腹水抗体进行12% SDS-PAGE电泳，结果显示：纯化后的抗体出现了3条带：50 kD的重链、25 kD的轻链和大小约100 kD的条带。煮沸后50 kD的重链条带明显变强，100 kD的条带变弱，25 kD的轻链煮沸前后条带强弱相差不大(图4A)。100 kD的条带为重链与重链的聚合体，是由于两条重链间的二硫键没有完全破坏所形成。凝胶图上杂蛋白条带很少，说明纯化后的单克隆抗体达到了很高的纯度，可以用于后续实验。Western Blot结果显示：三株抗体与重组蛋白反应后出现单一条带(图4B、C、D)，说明筛选的3株单抗能够特异识别重组NS1蛋白。使用间接ELISA法测定纯化后的单克隆抗体的效价，结果显示：6B8的效价可达到1∶51 200，7D11的效价为1∶3 200，3E2的效价最高，可达到1∶640 000(图4E)。

(A)SDS-PAGE鉴定纯化后的单克隆抗体(M：预染蛋白质相对分子质量标准；1：腹水(稀释10倍)；2：辛酸沉淀纯化；3：未煮沸的50%硫酸铵沉淀纯化；4：煮沸的50%硫酸铵沉淀纯化；5：未煮沸的纯化后单克隆抗体；6：煮沸的纯化后单克隆抗体)。(B)Western Blot鉴定3E2。(C)Western Blot鉴定6B8。(D)Western Blot鉴定7D11。(E)单克隆抗体的效价测定。

3 讨 论

ZIKV属于黄病毒属成员，同属的JEV、DENV、YFV等病毒均在我国流行，因此ZIKV也有在我国有大规模暴发的可能。目前没有任何针对ZIKV的抗病毒药物，预防的疫苗仍在临床试验阶段[7]，早期诊断可以为患者节省宝贵的时间，因此，在边境口岸建立ZIKV快速检测技术，进行ZIKV的现场筛查和检测就显得尤为重要。

本研究中，诱导表达的温度和诱导时间都是至关重要的。温度过低，由于酶活性降低导致生物大分子合成速度变慢，不利于高效表达重组蛋白；而温度过高，蛋白虽然能大量表达，但不利于其形成正确的空间构象。本实验中将重组表达菌在16 ℃诱导8 h后发现，重组蛋白表达量低，与诱导前无明显差别。而当诱导条件改为37 ℃诱导4 h后，经收集菌体、超声破碎细胞发现，重组蛋白大量表达，并主要以包涵体的形式存在。包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒。而尿素是一种变性剂，可以使蛋白变性，从而变成可溶的形态。对包涵体进行洗涤，在溶解包涵体时发现2 mol/L和4 mol/L尿素不能溶解重组蛋白，而8 mol/L尿素可以溶解大部分的重组蛋白。本研究采用透析复性来恢复蛋白质的生物活性，先将蛋白浓度调节至0.1～1 mg/mL，因浓度太高容易形成聚体沉淀，浓度太低不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，容易变性。然后在4 ℃条件下，每隔3 h梯度稀释透析液，当透析至1 mol/L尿素时，有大量蛋白发生沉积，目的蛋白回收率很低，因此当透析至2 mol/L尿素后，先用镍柱亲和层析法对收集的蛋白进行纯化，即用含2 mol/L尿素的不同浓度的咪唑进行梯度洗脱，分别收集流穿液和洗脱液，然后将洗脱液用1 mol/L尿素、PBS梯度透析复性，在透析过程中，只有少量蛋白发生了沉积现象，目的蛋白的回收率较高。本研究在动物免疫时选取了弗式佐剂以及皮下注射的免疫策略，通过对细胞融合这一关键步骤的把握，保证了较好的阳性克隆率。融合后至细胞生长到孔底面积的1/3～1/2时进行亚克隆，避免发生阳性细胞漏检和染色体丢失的情况。采用操作简便的有限稀释法，确保了杂交瘤细胞系的稳定性和抗体分泌效价高的特点。经过4次克隆化，使获得的杂交瘤细胞培养上清阳性率达100%，得到的杂交瘤细胞株能稳定、高效的分泌抗NS1蛋白的单克隆抗体，为后续建立针对NS1蛋白的ELISA检测方法及相关研究提供了基础。