龟甲人参鹿茸片主成分组方合理性研究

翟兴月，冯明明，佟长青，李 伟

（1.大连医科大学附属第二医院临床营养科，辽宁大连 116023；2.大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁大连 116023）

中药有药食同源的说法，因此有很多的中药既可以作为药品，赋予其药性功能，同时又可以作为保健食品的原料，利用其保健作用。2002年卫生部发布的《关于进一步规范保健食品原料管理的通知》中公布了可用于保健食品的人参等114种物品名单[1]，龟甲、人参和马鹿茸都列其中。龟甲具有滋阴作用，因此具有较好的应用前景。但由于龟甲含有的碳酸钙为44.28%~55.85%，造成龟甲食用的不便，因此较少出现在保健食品中[2]。人参是重要的中药，同时它具有保健作用，如免疫调节和抗疲劳等，因此它也经常在保健品中使用[3]。鹿茸最早见于《神农本草经》，《中华人民共和国药典》中记载的鹿茸是鹿科动物梅花鹿（Cervus nippon Temminck，简称花鹿茸）或马鹿（Cervus elaphus Linnaeus，简称马鹿茸） 的雄鹿未骨化密生绒毛的幼角[4]。鹿茸具有大补阳虚、壮肾阳、调精血、强筋骨、调冲任、托疮毒的作用[5]。目前，市场上常见人参保健品、鹿茸保健品很多。中药的疗效特点在于多成分联合、剂量少、多靶点、需要长时间作用[6]。在有些方面，中药的复方优于单方。对于中药复方作用原理的研究，研究人员进行了大量的工作，其中以薛燕[6]提出的中药复方作用原理的“散弹理论”为大家所认可，这一理论后来发展为多靶点理论。赵军宁[7]认为中药复方作用的特点在于“杆秤原理”和适度原理。因此，可以认为中药复方具有较大的临床优势，以中药材为基础的复方保健食品同样具有这一优势。

龟鹿二仙膏是由龟板0.5 kg，鹿角1.5 kg，枸杞子300 g，人参150 g组成[8]。由此可见，由龟甲、人参、鹿茸为主要原料组成的保健品具有理论依据及合理性。龟甲具有的滋阴作用与人参、马鹿茸具有抗氧化、促进免疫功能的作用是一致的。因此，这3种物质组合起来依靠多靶点联合作用，可以充分发挥保健功效。试验对龟甲人参鹿茸片组方主成分合理性进行了研究，以期为开发龟甲人参鹿茸片保健食品提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

龟甲粉、鹿茸、人参，深圳市凯联健康生物科技有限公司提供提供。

绵羊红细胞（SRBC）、补体、Hank's液、鸡红细胞，北京索莱宝科技有限公司提供；RPMI1640培养液，美国Gibco公司提供；都氏试剂，Sigma公司提供。

6~7周清洁级昆明种小鼠，体重为18~22 g，雌性，购于大连医科大学实验动物研究中心。于12 h黑暗、12 h光亮的塑料饲养箱内饲养，室温23±2℃，湿度40%~60%，自由采食和饮水。

1.2 龟甲人参鹿茸片组方主成分可溶性蛋白质、多糖含量测定

不同组成的龟甲人参鹿茸片组方主成分按照质量体积比1∶100，加dH2O，于100℃下煮沸30 min后，冷却至室温，补加dH2O至初始时的量，以转速2 000 r/min离心20 min。取上清液，测定蛋白质含量及多糖含量。

蛋白质含量测定采用Folin-酚法，多糖含量测定采用苯酚-硫酸法。

1.3 抗体生成细胞测定

采用Jerne改良玻片法进行抗体生成细胞测定[9]。40只昆明种小鼠随机分为4组：对照组和3个组方组（组方1为龟甲2 g，人参2 g，马鹿茸0.5 g；组方2为龟甲2 g，人参3 g，马鹿茸 0.5 g；组方3为龟甲3 g，人参2 g，马鹿茸 0.5 g）。龟甲人参鹿茸粉悬溶于生理盐水中，每天定时等体积灌胃1次，按照0.45 g/（kg·bw）的组方剂量进行灌胃，连续灌胃30 d后，每只小鼠腹腔注射2 mL 2%（V∶V）绵羊红细胞（SRBC） 悬液进行免疫4 d。4 d后小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，于无菌Hank's液研磨，并清洗2次，用RPM1640培养液中制成5×106个/mL小鼠脾细胞悬液。在试管中加入与等量Hank's液混合的培养液0.5 mL，10%的SRBC 50，20 μL小鼠脾细胞悬液（5×106个/mL），迅速混匀后倾倒于玻璃板上的琼脂糖薄层上，每只小鼠铺2个玻璃板，在37℃，5%的CO2培养箱中孵育1.5 h后，加入稀释好的补体溶液于玻璃片架凹槽中，再孵育1.5 h后弃去补体，计空斑数[9]。

1.4 半数溶血值（HC50）测试

按1.3方法对昆明种小鼠连续灌胃各组方30 d后，每只小鼠腹腔注射2 mL 2%（V∶V）绵羊红细

1.5 统计学处理

2 结果与分析

2.1 龟甲人参鹿茸片组方主成分可溶性蛋白质、多糖含量

研究表明，龟甲每日服用2~3 g可以起到增强免疫力的作用。卫生部发布《批准人参（人工种植）为新资源食品的公告（2012年第17号）》，批准种植人参为新资源食品，限定食用量≤3 g/d。因此，设计出3种不同的组方，进行其主成分可溶性蛋白质、多糖含量测定。

各组方的蛋白质及多糖含量见表1。胞（SRBC）悬液进行免疫4 d[10]。4 d后摘眼球取血将采集的全血于37℃下恒温30 min，然后置于4℃冰箱中1 h，在转速2 000 r/min下离心3 min，分离血清。用生理盐水稀释血清200倍。取稀释血清1 mL置于试管内，加入0.5 mL 10%SRBC及1 mL补体，以生理盐水作为对照，置37℃下恒温30 min，冰浴终止反应。以转速2 000 r/min离心3 min，取上清1 mL，加都氏试剂3 mL，于540 nm处测各管的吸光度，同时取0.25 mL 10%SRBC及4 mL都氏试剂于另一试管，混匀放置10 min后于波长540 nm处作为空白对照[10]。半数溶血值（HC50）计算如下：

表1 各组方的蛋白质及多糖含量

由表1可知，龟甲2 g，人参3 g，马鹿茸0.5 g的组方可溶性蛋白质、多糖含量最高，分别为1 159.8，62.0 μg/mL。根据《中华人民共和国药典》中规定，龟甲的质量控制方法为检测其水溶性浸出物。人参的有效成分为检测其所含有的人参皂苷Rg1和人参皂苷Re。另一方面，大量文献报道，人参蛋白质、多糖是人参的重要活性部位。鹿茸的蛋白质、肽类、多糖是其重要活性部位。因此，采用测定水溶性浸出物中蛋白质及多糖含量，可以间接反映出龟甲人参鹿茸片主要功效成分的含量。

2.2 不同组方对昆明种小鼠体液免疫功能的影响

按1.2方法对小鼠连续灌胃各组方30 d后，用Jerne改良玻片法进行抗体生成细胞测定，计算溶血空斑数。

各组方对小鼠溶血空斑数的影响见表2。

表2 各组方对小鼠溶血空斑数的影响 （，n=10）

表2 各组方对小鼠溶血空斑数的影响 （，n=10）

组 方 动物数/只 溶血空斑数/个×10-6脾细胞对照组组方1组方2组方3 10 10 10 10 204.7±41.3 254.6±51.9 319.4±44.5 283.1±46.0

由表2可知，组方2的溶血空斑数最多。溶血空斑数的多少代表着B细胞抗体产生的能力强弱[11]。

抗体生成细胞数和半数溶血值（HC50）体现了体液免疫功能的强度[11]。

龟甲粉对小鼠HC50的影响见表3。

表3 龟甲粉对小鼠HC50的影响 ，n=10）

表3 龟甲粉对小鼠HC50的影响 ，n=10）

组 方 动物数/只 HC50对照组组方1组方2组方3 10 10 10 10 86.9±17.6 106.4±18.7 147.2±23.7 121.8±22.1

由表3可知，组方2的增加小鼠半数溶血值（HC50）最多。表2和表3都表明了组方2对小鼠体液免疫功能增强最多。

由上述结果可知，组方2对昆明种小鼠体液免疫功能促进作用最强，可溶性蛋白质、多糖含量最高。从组方2与组方1和组方3相比，组方2的人参含量最多，组方3的龟甲粉含量最多。因此，组方中人参的量对可溶性蛋白质、多糖含量贡献大于龟甲的量。

3 结论

由龟甲2 g，人参3 g，马鹿茸0.5 g构成的组方2可溶性蛋白质、多糖含量最高，分别为1 159.8，62.0 μg/mL。3种组方中，组方2促进小鼠B细胞抗体产生的能力强，增加小鼠半数溶血值（HC50）最多，对小鼠体液免疫功能增强最多。因此，组方2是龟甲人参鹿茸片组方主成分的合理组成。