酱醅与豆酱微生物关系研究

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(沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866)

豆酱作为传统发酵豆制品之一,是以大豆为主要原料,经霉菌、酵母菌和乳酸菌等多种微生物协同发酵而成[1],因其独特的风味,长期以来深受东亚地区人们的喜爱[2-4]。豆酱含有蛋白质、蛋白黑素、肽类、异黄酮等多种有益人体健康的活性物质,具有极好的保健功能[5]。

豆酱的生产过程主要分为两个阶段,前期制曲和后期发酵[6]。其中制曲又称制醅,此阶段尤为重要,不仅为豆酱发酵提供丰富的微生物资源,也为后期发酵提供了良好的物质基础,制醅的好坏将直接影响豆酱的风味。目前,工业制醅大多采用人工接种制醅法,如添加米曲霉(Aspergillusoryzae)和黑曲霉(Aspergillusniger)[7],而在我国的农村地区,大多采用天然接种制醅法,相比于人工接种制醅,天然接种制醅法发酵时间较长。酱醅发酵成熟后,将其按比例添加到一定浓度的盐水中自然发酵,直至发酵成熟,此过程为后期发酵。尽管已有研究表明添加单一菌种制醅使得豆酱的风味和适口性远不如传统发酵豆酱[8],但是对酱醅与豆酱之间的关系研究还相对较少,目前还未能找到差异的根本原因。因此,研究酱醅与豆酱微生物之间的关系对豆酱产业的发展至关重要。

豆酱作为我国民族特色的传统酿造产品,近年来其发酵过程正不断地被科研工作者剖析,而第二代测序技术则提供了重要的技术支持。Jung等利用焦磷酸测序技术对酱醅多样性的研究表明,芽孢杆菌属(Bacillus)是酱醅发酵过程中的优势细菌菌属[9],而乳酸菌中的优势菌属为肠球菌属(Enterococcus)[10]。Jeong等研究表明粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)和屎肠球菌(Enterococcusfaecium)是酱醅的优势菌种[11]。而国内也有学者研究酱醅发酵过程中微生物的多样性,安飞宇等采用IlluminaMiSeq测序方法对酱醅的多样性研究表明，毛霉菌(Mucor)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、乳杆菌(Lactobacillus)及魏斯氏菌(Weissella)是酱醅发酵过程中的优势类群[12]。姜静等应用Miseq测序方法对酱醅中微生物多样性进行分析,结果显示乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)和明串珠菌属(Leuconostoc)为主要的细菌菌属,主要真菌菌属为青霉菌属(Penicillium)、毛霉菌属(Mucor)[13]。现阶段,国内外学者对酱醅和豆酱的微生物变化规律研究已经非常成熟,但是对酱醅与豆酱微生物关系的研究却未曾见报道。IlluminaMiSeq与其他测序技术相比,通量高、成本低,因此应用较为广泛,几乎涵盖了测序应用的各个方面[14]。因此,本试验采用IlluminaMiSeq高通量测序检测不同方式制作的酱醅及其发酵豆酱的微生物群落组成,从而分析酱醅与酱之间微生物关系,更进一步为实现高质量豆酱的工业化生产提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

三份酱醅及其发酵前期不同阶段豆酱：自然发酵酱醅(LK)及其发酵0、7和14 d豆酱样品(L1、L2、L3) 辽宁省沈阳市;酱醅(FK)及其发酵0、7和14 d豆酱样品(F1、F2、F3) 辽宁省阜新市某食品公司;自然发酵酱醅(SK)及其发酵0、7和14 d豆酱样品(S1、S2、S3) 吉林省四平市。

TruSeqTM试剂盒 上海美吉生物医药科技有限公司;NanoDrop 2000C超微量分光光度计 北京凯慕生物技术有限公司;ABI GeneAmp® 9700型PCR仪 北京卓悦联合生物科技有限公司;DYCP-31BN 型琼脂糖凝胶电泳仪 中国深华生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA的提取 参照文献[15]的方法提取样品总DNA。DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测,用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性[12]。所提取的DNA于-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增及测序 以50 ng DNA为模板,用上游引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和下游引物806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)扩增V4～V5区域。以50 ng DNA为模板,用ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)为引物扩增真菌ITS1区域。扩增体系为20 μL,4 μL 5×FastPfu缓冲液,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μL引物(5 μmol/L),0.4 μL FastPfu聚合酶,加超纯水至20 μL。反应参数:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循环30次;72 ℃延伸7 min。PCR产物用质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳(100 V恒压电泳30 min)检测。此外,分别向其PCR产物的末端加上含有Index的接头,以便进行IlluminaMiSeq测序。

MiSeq建库及基因测序委托上海美吉生物科技有限公司进行。

1.3 数据分析

根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列,并校正序列方向,在97%的相似水平下对所有序列进行OTU划分,基于OTU的分析结果,采用对样本序列进行随机抽样的方法,使用QIIME软件分别计算每个样本的四种生物多样性指数(Chao1、Ace、Shanno和Simpson),并作出稀释曲线,基于tax_summary_a文件夹中的数据表,利用R语言工具作图,获取各样本在门和属水平上的组成和丰度分布,从而对三个来源的酱醅与豆酱中的微生物进行多样性分析。

2 结果与分析

2.1 样品测序数据

OTU(Operational Taxonomic Units)是在系统发生学研究或群体遗传学研究中,为了便于分析,人为给某一个分类单元(相似度≥96%)设置的同一标志。多样性指数是反映丰富度和均匀度的综合指标。Chao或ACE指数越大,说明群落丰富度越高;Shannon值越大,Simpson指数值越小,说明群落多样性越高[16]。如表1所示,各样品细菌和真菌的OTU数及Alpha多样性指数。在样品前期发酵过程中,三个来源酱醅样品的OTU数明显低于其豆酱的OTU数,且豆酱细菌的OTU数均高于真菌的OTU数,酱醅和豆酱真菌OTU总数为1485,细菌OTU总数为2757,细菌OTU数约为真菌的2倍。S家、F家和L家豆酱真菌OTU总数分别为525、518和442,细菌OTU总数分别为1018、877和862。通过Chao和ACE指数对样品丰富度的比较发现,除SK外,真菌的Chao和ACE指数明显低于细菌的Chao和ACE指数,说明酱醅样品中细菌的丰富度比真菌的高,而SK样品真菌丰富度高于细菌丰富度。三家酱醅细菌Chao和ACE指数排序分别为SK6

表1 样品OTU数和Alpha多样性指数Table 1 The OTU and Alpha of samples

2.2 酱醅与豆酱微生物多样性

2.2.1 S样品酱醅与豆酱微生物多样性 如图1所示,从S样品酱醅与豆酱真菌门水平分布来看,共检测出两个已知真菌门,其酱醅中,子囊菌门(Ascomycota,77.55%),接合菌门(Zygomycota,22.31%)为酱醅中的优势菌门;后期发酵过程中,豆酱前三阶段子囊菌门和接合菌门依然为豆酱中的优势菌门,占比在77.55%～82.6%、22.31%～17.4%之间。从S样品酱醅与豆酱细菌门水平分布来看,共检测出3个已知细菌门,其中酱醅厚壁菌门(Firmicutes)占90.01%,为酱醅的优势菌门,变形菌门(Proteobacteria)占8.83%;后期发酵过程中,豆酱前三阶段厚壁菌门依然为优势菌门,所占比例为86.8%～99.56%,变形菌门仍有7%存在于S1阶段,但S2、S3阶段变形菌门迅速减少至1%以下。

图1 酱醅与豆酱样品真菌和细菌在门水平分布Fig.1 The distribution of fungi and bacteria of meju and soybean paste in phyla注:A代表S样品酱醅与豆酱真菌在门水平的分布, B代表S样品酱醅与豆酱细菌在门水平分布。

如图2所示,S样品酱醅和豆酱发酵前三阶段共检测出4个已知真菌属。酱醅中的优势菌为青霉菌(Penicillium)、毛霉菌(Mucor)和赤霉菌(Gibberella),分别占55.75%、22.31%和19.73%;后期发酵过程中,青霉菌和毛霉菌依然为优势菌群,所占比例在80.02%～82.29%和11.89%～18.23%之间,但赤霉菌在下酱后迅速减少,S1阶段占1.55%,S2、S3阶段逐渐减少到1%以下。

图2 酱醅与豆酱样品真菌在属水平的分布Fig.2 The distribution of fungi of meju and soybean paste in genus

如图3所示,S样品酱醅和豆酱共检测出10个已知细菌菌属,7个菌属含量在1%以上。酱醅中存在3个细菌菌属,分别为芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)和乳杆菌(Lactobacillus),其中芽孢杆菌占86.88%,为酱醅的优势菌,假单胞菌占12.86%,为次优势菌,乳杆菌仅占0.01%;后期发酵过程中,芽孢杆菌逐渐减少,由S1的68.35%减少到S3的12.56%。豆酱中芽孢杆菌主要为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌[17],随着发酵的进行,发酵体系内总酸含量升高,pH下降,由于较低的pH对芽孢杆菌的生长产生抑制作用[18],所以S样品芽孢杆菌的含量逐渐减少。假单胞菌含量在豆酱发酵过程中逐渐降低,在S3中仅占0.06%,假单胞菌为导致食品腐败的重要腐败菌[19],在实验室前期研究中,成熟豆酱中并没发现假单胞菌的出现,说明随着发酵时间的延长,假单胞菌逐渐减少并最后全部死亡。四联球菌(Tetragenococcus)在S2阶段迅速增加,到S3阶段成为豆酱中占绝对优势的细菌。

图3 酱醅与豆酱样品细菌在属水平的分布Fig.3 The distribution of bacteria of meju and soybean paste

2.2.2 F样品酱醅与豆酱微生物多样性 如图4所示,F样品酱醅和豆酱发酵前三阶段共检测出3个已知真菌菌门,分别为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和接合菌门(Zygomycota)。在酱醅阶段,子囊菌门(54.21%)和接合菌门(42.38%)为优势菌门,担子菌门占3.41%;后期发酵过程中,子囊菌门依然为豆酱发酵的优势菌门,并且随着发酵时间的增加而增加,含量在68.84%～77.17%之间,接合菌门为次优势菌门,含量在22.47%～28.82%之间,但随着发酵时间的延长含量逐渐减少。F样品酱醅和豆酱发酵前三阶段共检测出3个已知细菌菌门,分别为厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)。在酱醅阶段,厚壁菌门(75.2%)为F样品的优势菌门,放线菌门(9.61%)和变形菌门(15.19%)为次要菌门;后期发酵过程中,厚壁菌门依然为优势菌门,并且随着发酵时间的延长含量逐渐增加,所占比例在78.36%～92.3%之间,放线菌门在F1阶段含量增加,占18.74%,F2、F3阶段放线菌门含量减少,占10.4%和7.48%。变形菌门含量在下酱后迅速减少。

图4 酱醅与豆酱样品真菌和细菌在门水平分布Fig.4 The distribution of fungi and bacteria of meju and soybean paste in phyla注:A代表F样品酱醅与豆酱真菌在门水平的分布, B代表F样品酱醅与豆酱细菌在门水平分布。

如图5所示,F样品酱醅和豆酱发酵前三阶段共检测出5个真菌菌属。在酱醅中,优势菌属为毛霉菌属(Mucor,41.96%),主要菌属为青霉菌属(Penicillium,23.91%)和赤霉菌属(Gibberella,21.37%);后期发酵过程中,发酵前期的优势菌属为青霉菌属,占比在57.22%～71.65%之间,毛霉菌属为主要菌属,含量在22.46%～28.82%之间,赤霉菌属在下酱后迅速减少,含量仅在1.05%～1.33%之间。毛霉菌在酱醅中大量存在,毛霉菌可以分泌多种多样的酶,如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等,这些酶可以将蛋白质、淀粉和脂肪等大分子物质降解为利于其他微生物利用的小分子物质,它也可以协同细菌、酵母菌的发酵作用,生成一些有机酸、酯类等物质。研究表明,毛霉菌是腐乳发酵的主要菌种,其可以提高大豆蛋白的水解率[20]。酱醅中的青霉菌和毛霉菌在豆酱中继续生长,但青霉在豆酱中所占比例基本保持稳定,毛霉菌在下酱后含量降低,说明相对于青霉菌,毛霉菌在高盐环境中很难生存。

图5 酱醅与豆酱样品真菌在属水平的分布Fig.5 The distribution of fungi of meju and soybean paste in genus

如图6所示,F样品酱醅和豆酱发酵前三阶段共检测出11个已知细菌菌属。在酱醅阶段优势细菌为乳杆菌(Lactobacillus,16.79%),主要细菌为在酱醅阶段优势细菌为乳杆菌(Lactobacillus,16.79%)，主要细菌为枝芽孢杆菌(Bacillussubtilis,6.32%)、葡萄球菌(Staphylococcus,5.41%)、短状杆菌(Lactobacillusbrevis,5.89%)和肠球菌(Enterococcus,3.57%) ;后期发酵过程中,优势菌为葡萄球菌和肠球菌(Enterococcus),占比在10.06%～25.38%和11.38%～24.53%之间,葡萄球菌和肠球菌在酱醅和豆酱中均检测到,且豆酱中所占比例比酱醅中大,乳杆菌随着发酵时间的增加而减少,欧文氏菌在豆酱中消失。四联球菌(Tetragenococcus)在F3阶段占42.03%,为此阶段的优势菌属。

图6 酱醅与豆酱样品细菌在属水平的分布Fig.6 The distribution of bacteria of meju and soybean paste in genus

2.2.3 L样品酱醅与豆酱微生物多样性 如图7所示,L样品酱醅和豆酱发酵前三阶段共检测出3个已知真菌菌门,分别为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和接合菌门(Zygomycota)。在酱醅中,子囊菌门(99.99%)是绝对优势菌门;后期发酵过程中,子囊菌门依然为L样品豆酱发酵的优势菌门,占比在91.54%～94.32%之间,酱醅中没有出现的担子菌门和接合菌门,在豆酱发酵前期出现,占比分别在2.66%～7.39%和1.02%～5.8%之间。L样品酱醅和豆酱发酵前三阶段共检测出3个已知细菌菌门,分别为厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)。在酱醅中,厚壁菌门(75.2%)为优势菌门，变形菌门(26.54%)为主要细菌菌门;后期发酵过程中,在豆酱发酵初期,厚壁菌门含量随着发酵时间的延长而增加,占比在78.36%～92.3%之间,放线菌门基本维持在7.48%～10.4%之间,变形菌门在L1阶段占12.9%,随后的L2和L3阶段下降到1%以下。

图7 酱醅与豆酱样品真菌和细菌在门水平分布Fig.7 The distribution of fungi and bacteria of meju and soybean paste in phyla注:A代表L样品酱醅与豆酱真菌在门水平的分布, B代表L样品酱醅与豆酱细菌在门水平分布。

如图8所示,L样品酱醅和豆酱发酵前三阶段共检测出7个真菌菌属。酱醅中小囊菌(Microascus)占81.63%,青霉菌(Penicillium)占16.19%,为酱醅的优势菌;L1中青霉菌占81.55%,异常威克汉姆酵母菌(Wickerhamomyces)占8.02%,而小囊菌属仅仅占0.42%;L2中青霉菌占68.6%,小囊菌属占0.67%,异常威克汉姆酵母菌占11.3%;L3中青霉菌占71.36%,异常威克汉姆酵母菌占18.45%,小囊菌占0.19%,其含量在豆酱发酵阶段明显下降。LK中含量极少的异常威克汉姆酵母菌在豆酱中所占比例仅比青霉菌少,是豆酱的次优势菌属。酵母菌在豆酱发酵中的作用主要是发酵糖类生成糖、酸和酯类等小分子物质。前期研究表明,酵母菌主要存在于豆酱发酵前期[21]。酱醅阶段,体系内缺少水分,而在豆酱发酵过程中,由于盐水的加入,使发酵体系内潮湿多水,酱醅中含量极少的酵母菌在适合的条件下迅速繁殖。

图8 酱醅与豆酱样品真菌在属水平的分布Fig.8 The distribution of fungi of meju and soybean paste in genus

如图9所示,L样品酱醅和豆酱发酵前三阶段共检测出6个细菌菌属。酱醅中乳杆菌(Lactobacillus)占88.17%、明串珠菌(Leuconstoc)占7.95%,肠球菌(Enterococcus)占1.38%;豆酱L1中乳杆菌占51.55%,肠球菌占12.59%,明串珠菌占10.9%,可以看出在酱醅LK和豆酱L1中优势菌都是乳杆菌属,其次是明串珠菌属,肠球菌属在L1中比例上升,但L2、L3阶段肠球菌比例又下降,L2中四联球菌占96.55%,而乳杆菌只占到1.91%,L3中四联球菌占95.23%,乳杆菌2.59%,说明随着发酵的进行,豆酱中的优势菌群逐渐变为四联球菌。

图9 酱醅与豆酱样品细菌在属水平的分布Fig.9 The distribution of bacteria of meju and soybean paste in genus

3 讨论

Kim等建立了酱醅的最佳生产条件并检测了酱醅的品质特征,发酵体系内外部环境中细菌的差异对发酵结果有较大影响,而真菌影响相对较小,发酵使用水中真菌的差异是体现真菌发酵作用的一个关键指标[22-23]。在本研究中,SK样品酱醅的主要细菌为芽孢杆菌,而FK样品中枝芽胞杆菌少量存在,LK样品中芽孢杆菌为非主要菌;三份酱醅样品中的优势真菌都含有毛霉菌属,与前期研究结果一致,说明环境差异影响细菌的群落组成,对真菌影响较小。随着发酵的进行,酱醅中未检测出的四联球菌均是三份豆酱样品的优势的细菌,四联球菌作为促进健康的益生菌,广泛存在于豆酱、酱油、鱼酱等发酵食品中,酵母菌参加代谢反应的产物主要为醇类和醛类,而四联球菌属代谢的产物主要是以乳酸为主要酸的多种有机酸类,两者结合可以显著提高产品中酯类物质含量,所以四联球菌在改善豆酱风味方面具有重要作用[24-25]。

Kim等采用DGGE技术分析对韩国的10份豆酱(5份商品酱和5份自制酱)进行了微生物多样性检测,结果表明,肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroide)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)和屎肠球菌(Enterococcusfaecium)为优势细菌;真菌的分析结果表明毛霉菌、米曲霉和汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)是豆酱样品中最常见的真菌[26]。在本研究中,S和L样品为自制样品,而F样品酱醅为商品酱醅,它们的微生物组成在门水平上无明显差异,酱醅与豆酱中的优势真菌都为青霉菌,但在属水平上细菌群落组成差异明显。自然发酵样品与商品酱醅相比发酵时间较长,主要以空气和自身携带的微生物进行发酵,而工业制醅大都采用纯种发酵,发酵时间较短。在发酵初始阶段,F样品群落组成复杂,主要细菌为乳杆菌(Lactobacillus)、枝芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、葡萄球菌(Staphylococcus)、短状杆菌(Lactobacillusbrevis)和肠球菌(Enterococcus) ,相对于自然接种发酵,这些微生物并非传统发酵豆酱中的优势菌,但随着发酵的进行,四联球菌含量上升,成为优势菌,与自然发酵豆酱无明显差异,说明发酵前期微生物的差异是影响豆酱风味的根本原因。

4 结论

本文对酱醅与豆酱微生物关系进行了研究,结果表明:酱醅和豆酱优势菌门基本相同,优势菌门都为子囊菌门和厚壁菌门,变形菌门主要存在于酱醅中;酱醅与豆酱中的优势真菌都为青霉菌和毛霉菌,但细菌的组成不同,主要细菌为芽孢杆菌、乳杆菌和四联球菌;此外,不同酱醅发酵的豆酱发酵前期细菌群落组成差异明显,随着发酵的进行,优势菌属无明显差异。随着科学技术的发展,多组学技术为研究酱醅及豆酱发酵过程中微生物的相互作用及其作用机制提供了技术支持,因此在此后的研究中应结合这些技术全面分析微生物的代谢作用,从而指导工业化生产。