Bacillus sphaericus 2297蛋白酶基因sph 在毕赤酵母中的表达及重组酶酶学性质

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(1.淮海工学院海洋生命与水产学院,江苏连云港 222005; 2.江苏省海洋资源开发研究院,江苏连云港 222005; 3.淮海工学院海洋资源与环境学院,江苏连云港 222005)

蛋白酶是一种重要的工业用酶,广泛应用于食品、洗涤剂、医药、皮革、污水处理等多种领域[1-2]。其在水相中主要催化的是肽键的水解反应,而在有机相中主要催化的是水解反应的逆反应、肽键的合成反应[3]。随着非水酶学的快速发展,利用蛋白酶在有机相中合成小肽已经成为一大研究热点,然而大多数的天然蛋白酶在有机溶剂容易失活,并且稳定性极差,这极大地限制了其在有机合成领域的应用[4]。虽然通过固定化[5-7]、化学修饰[8]等方法可以提高其有机溶剂耐受性,但成本高,并且会降低酶活性。获得天然耐受有机溶剂的蛋白酶或者通过分子酶工程改造蛋白酶,提高其有机溶剂耐受性,则可降低成本[9]。

获得耐有机溶剂蛋白酶的重组工程菌是研究其有机溶剂耐受性分子机制及通过分子酶工程提高蛋白酶有机溶剂耐受性的前提条件。Ogino等[10]克隆了PseudomonasaeruginosaPST-01所产的耐有机溶剂蛋白酶并在E.coli中进行表达,获得分子量约为33.1 kDa的胞内酶。朱富成等[11]从P.aeruginosaPT121克隆得到1497 bp蛋白酶基因,并将其在E.coliBL21中进行表达,得到约33.0 kDa的重组酶。承龙飞等[12]从蜡样芽胞杆菌WQ-2中克隆获得了1701 bp耐有机溶剂蛋白酶基因,并将其在枯草芽孢杆菌WB600中进行表达,获得了约为37.0 kDa的具有活性及有机溶剂耐受性的蛋白酶,且重组菌发酵产酶活力比野生菌提高了约4倍,达到了17400 U/mL。工程菌的构建为蛋白酶有机溶剂耐受性的分子机制的全面研究以及后期的蛋白改造奠定了良好的基础。

本研究组筛选得到菌株BacillussphaericusDS11分泌有机溶剂稳定性蛋白酶,在25%的正己醇、苯、二甲苯等有机溶剂处理14 d后,仍然保持80%以上的酶活性[13-14]。B.sphaericusDS11蛋白酶基因同B.sphaericus2297蛋白酶基因sph的氨基酸相似度达到88%[15]。目前,B.sphaericus2297蛋白酶尚未被表达,其有机溶剂耐受性也未被研究。本研究计划全合成B.sphaericus2297sph基因,根据毕赤酵母的密码子偏好性进行优化,并构建重组酵母菌P.pastorisX33-ppicZalphA-sph,实现胞外表达,对重组酶进行酶学性质和有机溶剂耐受性研究,为进一步探索B.sphaericusDS11蛋白酶的耐有机溶剂特性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

E.coliDH5α本实验室保存;PichiapastorisX33 宝赛生物技术有限公司(杭州);质粒ppicZalphA 美国Invitrogen公司;酵母粉、蛋白胨、NaCl、葡萄糖、甘油、K2HPO4、KH2PO4分析纯,国药集团药业股份有限公司;有机溶剂甲醇、二甲苯、环己烷、正丁醇、生物素等 阿拉丁试剂有限公司;YNB培养基 青岛海博生物技术有限公司;DNA Marker,T4 DNA连接酶,限制性内切酶XbaI、ECORI、PmeI,质粒小抽试剂盒 宝生物工程有限公司(TaKaRa);B.sphaericus2279蛋白酶基因sphGenBank 登录号:AJ238598.1。

Q5000微量核酸蛋白检测仪 美国Quawell 公司;T100TMThermal CyclerPCR仪 美国Bio-RAD公司;凝胶电泳仪 美国Bio-RAD公司;酶标仪 南京宝诚生物技术有限公司;Gel DocTMEZ凝胶成像仪 美国Bio-RAD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白酶sph基因及引物的合成 将蛋白酶基因sph按毕赤酵母的密码子偏好性进行优化,在N端加上His标签,再在C、N端分别加上XbaI、ECORI的酶切位点后,交由南京思普金公司进行合成,合成的基因连接到PUC57上寄回。根据蛋白酶基因sph设计验证引物(上游引物SPH-DR1:5′-ATGGACTCTGAGGACTCTTTGGGT-3′;下游引物SPH-DF1:5′-AGAAGCGTAGTCGTCACCAATAGC-3′),由南京思普金生物公司合成。

1.2.2 重组表达载体的构建 将目的基因质粒PUC57-sph和载体质粒ppicZalphA用ECORI、XbaI进行双酶切,再通过凝胶电泳切胶回收酶切后的目的基因和载体质粒,用T4 DNA连接酶4 ℃过夜连接,得到重组质粒后,转化到E.coilDH5α感受态细胞,并涂布于卡那抗性(50 μg/mL)的LB平板上,37 ℃倒置过夜培养,筛选阳性克隆。挑取单菌落进行菌落PCR、提取质粒进行双酶切验证,并将验证正确的质粒送至生物公司测序,比对测序结果,将确认为阳性克隆的重组质粒命名为ppicZalphA-sph。

1.2.3 毕赤酵母工程菌的构建和验证 将重组质粒ppicZalphA-sph用限制性内切酶PmeI线性化,通过电击转化仪转化至毕赤酵母X33感受态细胞中,将5～20 μg的线性化产物加入到80 μL感受态细胞混匀,转至0.1 cm冰预冷的电转化杯中,1500 V电转,加入1 mL 1 mol/L山梨醇30 ℃培养3 h后,涂布于终浓度为100 μg/μL Zecoin的YPD平板,30 ℃ 培养3 d左右。挑取单菌落,用验证引物进行PCR验证。

1.2.4 重组毕赤酵母菌株的诱导表达 接种转化子于2 mL YPD中,30 ℃、200 r/min过夜培养,以1%的接种量接种100 μL于10 mL BMGY培养基中,于30 ℃、200 r/min培养至OD600为4～8。3000 r/min、1 min离心,收集菌体。弃去BMGY培养基,更换为20 mL BMMY培养基于30 ℃诱导表达,每24 h加入甲醇0.1 mL(甲醇终浓度为50 mL/L,V/V)并取样,诱导7 d,5000 r/min、15 min离心,收集得到上清粗酶液。由于目的基因合成时添加了His标签,所以使用镍亲和层析柱进行纯化,得到纯酶液。用导入空ppicZalphA的毕赤酵母X33的发酵液作为对照,将粗酶液、纯酶液以及对照组进行标准SDS-PAGE蛋白电泳(浓缩胶电泳电压50 V,分离胶电泳电压80 V),来验证目的蛋白是否成功表达。

1.2.5 蛋白酶活性的测定 本实验参照福林酚法测定蛋白酶活力[16]。在试管中加入40 ℃预保温的1 mL的酶液、1 mL 2% pH8.0的酪蛋白底物,40 ℃水浴反应10 min,加入2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸,静置10 min,终止反应。12000 r/min离心5 min,取1 mL上清液,加入5 mL 0.4 mol/L的碳酸钠和1 mL的福林酚试剂摇匀,40 ℃显色20 min,测定上清液的吸光度(A680)。对照组先添加2 mL三氯乙酸,反应后再添加酪蛋白底物。酶活单位(U/mL):在特定条件下,每分钟水解酪蛋白底物产生1 μg酪氨酸定义为1个酶活单位。

酶活计算公式:X=A×K×4/10×n

式中:A:样品平行试验的平均吸光度;K:吸光常数;4:反应试剂的总体积,mL;10:反应时间10 min;n:稀释倍数。

1.2.6 蛋白酶的酶学性质研究

1.2.6.1 最适反应温度和热稳定性 最适温度:将酶液与2%酪蛋白底物(pH8.0)混匀后分别置于20、30、40、50、60、70 ℃下反应10 min,测定酶液在不同温度下的酶活力,确定其反应的最适温度。

温度稳定性:将酶液分别在20、30、40、50、60 ℃下保温2、4、6、7、10 h后,在最适温度下测定剩余酶活力,以未保温酶液的酶为对照,对照组酶活定义为100%,确定重组酶的热稳定性。

1.2.6.2 最适反应pH和pH稳定性 最适反应pH:由于不同缓冲体系的缓冲范围不同,首先配制pH5.0～6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pH6.0～8.0的磷酸盐缓冲液、pH8.0～9.0的Tris-HCl缓冲液、pH9.0～10.0的甘氨酸-NaOH缓冲液,再用其配制不同pH的酪蛋白底物,再在最适温度下测定酶液在不同pH下的酶活力,确定其反应的最适pH。

pH稳定性:用pH5.0～10.0的缓冲溶液分别孵育酶液2、24 h后,在最适温度和pH条件下测定其剩余酶活力,并以未用缓冲液处理过的酶为对照,对照组酶活定义为100%,确定重组酶的pH稳定性。

1.2.6.3 金属离子对酶活性的影响 将EDTA作为缓冲液加入酶反应体系,使其终浓度为1 mmol/L,将0.1 mol/L的金属离子CoCl2、KCl、FeCl3、NaCl、LiCl、CaCl2、MgCl2、BaCl3、CdCl2、SrCl2作为缓冲液加入酶反应体系,使其终浓度分别为1、2.5 mmol/L,于最适温度和pH条件下测定剩余酶活力,以未加入金属离子条件下测定的酶活力为100%,确定不同金属离子对酶活力的影响。

1.2.6.4 有机溶剂对酶活力的影响 将酶液与正丁醇、环己烷、二甲苯、乙醇等有机溶剂混匀于30 ℃、180 r/min孵育,有机溶剂浓度为25%[17],并且在孵育时间为30 min、1 h、2 h、24 h、6 d时取样,于最适温度和pH条件下测定剩余酶活力,并以未加有机溶剂孵育的酶为对照,对照组酶活定义为100%,确定酶液对有机溶剂的耐受性。

1.3 数据处理

实验中每个处理重复3次,用Origin 9.0软件绘制曲线图以及分析数据显著性。

2 结果与分析

2.1 毕赤酵母工程菌的构建和验证

将耐有机溶剂蛋白酶基因sph插入到毕赤酵母分泌表达载体ppicZalphA中,得到重组质粒ppicZalphA-sph。将重组质粒ppicZalphA-sph用限制性内切酶PmeI线性化验证,目的基因片段约为1200 bp,质粒大小约为3600 bp,图1中的线性化片段大小与目的基因和质粒大小总和相符。再通过电击转化仪转化至毕赤酵母X33感受态细胞中,电击转化后涂布于平板培养。挑取单菌落用引物SPH-DF1、SPH-DR1验证,得到的片段大小约为1200 bp,与目的基因大小相符(图2),表明重组毕赤酵母工程菌P.pastorisX33-ppicZalphA-sph构建成功。

图1 重组质粒ppicZalphA-sphpmeI线性化结果Fig.1 Recombinant plasmid ppicZalphA- sphpmeI linearization result注:M:DNA Marker;sph:重组质粒线性化产物。

图2 重组酵母菌株P. pastoris X33-ppicZalphA-sph菌落PCR鉴定结果Fig.2 Results of PCR identification of recombinant P. pastoris X33-ppicZalphA-sph colonies注:M:DL2000 DNA Marker;1:PCR产物。

2.2 重组工程菌的诱导表达

对转化子进行甲醇诱导表达,诱导表达结果表明,挑选的转化子能够在发酵上清液中测到蛋白酶SPH酶活,诱导7 d后,酶活力最高。对诱导表达7 d的酶液进行SDS-PAGE电泳验证,表达产物分子量大小为32.64 kDa,与目的蛋白SPH大小相符(图3)。

图3 P. pastoris X33-ppicZalphA-sph诱导表达上清液SDS-PAGE电泳结果Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant P. pastoris X33-ppicZalphA-sph expression注:M:蛋白Marker;1:导入空质粒的酵母菌发酵上清液(对照);2:重组菌株诱导表达7 d的上清液; 3:纯化后的诱导表达7 d的上清液。

2.3 重组耐有机溶剂蛋白酶的酶学性质分析

2.3.1 最适温度与热稳定性 重组毕赤酵母菌株P.pastorisX33-ppicZalphA-sph经甲醇诱导后得到酶液,进行酶学性质表征。从图4可知,耐有机溶剂蛋白酶SPH在20～70 ℃内均有酶活,随着反应温度的升高,酶活先升后降。反应的最适温度为40 ℃,在30～50 ℃间具有较高的酶活(最高酶活的80%以上),温度超过50 ℃后,酶活开始明显下降,温度达到70 ℃时,酶活只剩最高酶活的30%左右。

图4 温度对蛋白酶活力的影响Fig.4 Effects of temperature on protease activity

由图5可以看出,蛋白酶SPH在20、30 ℃下具有良好的稳定性,保温10 h后酶活剩余80%以上;温度超过40 ℃后,酶的稳定性明显下降,在60 ℃下保温2 h,酶活下降超过50%,保温6 h后酶基本失活。

图5 温度对蛋白酶稳定性的影响Fig.5 Effects of temperature on protease stability

2.3.2 最适pH与pH稳定性 由图6可知,耐有机溶剂蛋白酶SPH在pH5.0～10.0范围内均有酶活,且随着pH的升高,酶活先升高后降低,其最适反应pH为8.0,pH为10.0时,酶活仍能保持70%以上,pH低于7.0时,酶活较低。由此可见,蛋白酶SPH为碱性蛋白酶。

图6 pH对蛋白酶活力的影响Fig.6 Effects of pH value on protease activity

由图7可知,用酶的最适反应pH8.0的缓冲液处理2、24 h对酶活性影响很小。酸性条件对酶活性影响较大,用pH5.0的缓冲液处理2 h后,酶活下降超过65%,处理24 h后,酶活性下降超过90%。其用pH7.0～9.0的缓冲液处理24 h后,酶活仍能保持在60%以上,说明蛋白酶SPH在弱碱性条件下(pH7.0～9.0)间具有良好的稳定性。

图7 pH对蛋白酶稳定性的影响Fig.7 Effects of pH value on protease stability

2.3.3 金属离子对酶活性的影响 不同金属离子对酶活力的影响不同,由图8可知,Co2+、Li+、Na+对酶活力没有明显影响;Fe3+、Ba2+对酶活有抑制作用,2.5 mmol/L的Fe3+对酶活的抑制最为明显,酶活下降60%以上;K+、Sr2+对酶活有明显的激活作用,尤其是1 mmol/L的K+使酶活提高了50%。

图8 金属离子对蛋白酶活力的影响Fig.8 Effects of metal ions on protease activity

2.3.4 有机溶剂对酶活性的影响 用25%的不同极性常数的有机溶剂处理蛋白酶后,酶活力保留情况如表1所示。孵育时间为30 min～2 h时,用二甲苯孵育的蛋白酶酶活力保留率最高,用正丁醇和环己烷孵育的蛋白酶酶活力保留率无显著性差异(p>0.05),与其它两组差异显著(p<0.05);当孵育时间为24 h～6 d时,不同有机溶剂孵育的蛋白酶酶活力保留率均有显著性差异(p<0.05)。且蛋白酶SPH在log POW为0.8～3.1之间的有机溶剂中具有较好的稳定性,有机溶剂处理酶液6 d后剩余酶活力仍能达到50%以上,而蛋白酶SPH在log POW为负值的乙醇溶液中,酶活力下降很快,处理6 d后,酶活力仅剩30%左右。Xu等人[18]的研究中,BacilluscereusWQ9-2所产的蛋白酶在37 ℃用50%的log POW为0.05～3.2的有机溶剂处理24 h后,酶活力保留率达到90%以上,与本文的重组蛋白酶SPH相比,其在log POW较低的有机溶剂中稳定性更高;Simkhada等人[19]的研究发现,来源于Streptomycesolivochromogenes的耐有机溶剂蛋白酶用25%的二甲苯处理3 d后,酶活力保留率仅为82%左右,而本实验结果表明重组蛋白酶SPH用二甲苯处理6 d后酶活力保留率仍达到76.8%,对二甲苯有着更好的耐受性。Uttatree等人[20]的研究中发现,来源于Bacillusmegaterium的耐有机溶剂蛋白酶在log POW大于2.0的有机溶剂中处理3 d后,酶活力保留率仅为68%左右,而本实验结果显示重组蛋白酶SPH在log POW大于2.0的有机溶剂中处理6 d后,酶活力保留率仍达到72%左右,说明蛋白酶SPH在log POW较大的有机溶剂中,具有更高的稳定性。

表1 有机溶剂对蛋白酶活力的影响Table 1 Effects of different organic solvents on protease activity

3 结论

本实验构建了蛋白酶SPH的重组酵母菌P.pastorisX33-ppicZalphA-sph,并通过蛋白电泳验证基因sph在毕赤酵母X33中成功表达,对重组蛋白酶SPH的酶学性质进行研究。研究结果表明,该酶的最适反应温度和pH分别为40 ℃、8.0,且其在较低温度(20～30 ℃)、弱碱性(pH7.0～9.0)条件下有较好的稳定性;Fe3+、Ba2+对酶活有抑制作用,K+、Sr2+对酶活有激活作用;经有机溶剂耐受性验证,重组蛋白酶SPH为耐有机溶剂蛋白酶。