实时荧光PCR定量测定肉制品中 羊源性成分

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(1.河南检验检疫鉴定咨询中心,河南郑州 450003; 2.河南出入境检验检疫局,河南郑州 450003)

肉制品掺假是食品市场中的重要问题,而目前利用掺杂使假、以次充好等手段制造的“假羊肉”事件屡屡出现,极大地侵犯了消费者的合法权益[1-2],因此建立准确、快速、有效的羊源性成分检测方法是必要的。

运用PCR和实时荧光PCR方法检测肉制品中的动物源性成分已经得到了较多的关注和研究[3]。田金辉等[4]运用T-RFLP(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)可以快速鉴定生鲜肉中羊源性成分。王颖等[5]运用荧光定量PCR方法检测畜肉食品中猪源性成分,灵敏度为0.1 μg/kg。

标准《SN/T 2051-2008食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法》[6]以试剂盒(大连TaKa-Ra公司)形式推出,引物及探针序列均不公布,不利于标准使用和推广。目前的国家标准、行业标准或是文献报道中,使用的检测方法多是定性检测方法[7-9],这些方法不能对部分掺假的肉类食品进行定量分析,因此需要建立准确性高、操作性强且易于推广的定量检测方法以满足市场需求[10]。

本研究针对羊源及脊椎动物通用引物和探针,并将其克隆到PMD-18-T载体,制备羊源和肉类通用基因的重组质粒以构建标准曲线,通过测定样品中羊源Ct值和肉类通用基因Ct值求得各自拷贝数,以拷贝数的比值为参照,进而判断肉制品是否故意掺假并衡量其掺假程度,为质检部门打击不法商贩、维护消费者权益提供有力的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

生鲜猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉等肉样、羊肉卷、精品小肥羊、自然羊肉、羊腿等肉制品 郑州市农贸市场或大型超市;蛋白酶K(20 mg/mL) TAKARA公司;组织裂解液:1 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、10%十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)、氯仿/异戊醇(24∶1)、3 mol/L醋酸钠 均为自配试剂;琼脂糖、LB培养基 生工生物工程(上海)股份有限公司;Tris-饱和酚、Godview染色剂、氨苄青霉素 北京索莱宝科技有限公司;无水乙醇、异丙醇、醋酸钠 均为国产分析纯;DNA Marker、Premix Ex 2×TaqTM(Probe qPCR)、pMD-18-T载体、工程菌DH5α感受态细胞、质粒销量制备试剂盒、琼脂糖凝胶快速回收DNA试剂盒 大连宝生物公司。

DT500电子天平 江苏常熟长青仪器厂;Lightcycle 1.5荧光定量PCR仪(Roche) 上海恒久医疗器械有限公司;Hermle Z36HK高速冷冻离心 HERMLE科技仪器有限公司;GRINDOMIX GM200组织匀浆机 莱驰有限公司;BioSpec-nano微量核酸蛋白仪 岛津企业管理(中国)有限公司;LabCycler Standard Plus梯度PCR仪 德国Senso公司;Thermo MaxQ4000恒温摇床 郑州普瑞斯科贸有限公司;INE5000恒温培养箱 美国Memmert公司;GBOX-HR-E-M凝胶成像系统 基因有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 肉样制备 取新鲜肉样的肌肉组织,剔除肌腱、脂肪,于匀浆机(8000 r/min)中匀浆10 s,匀质过程中不同肉类要分开处理,以防止不同来源的动物组织交叉污染。

1.2.2 DNA提取 采用酚/氯仿法提取肉样基因组DNA[11-12]。向样品中加入700 μL组织裂解液和20 μL蛋白酶K(20 mg/mL),上下颠倒混匀，于65 ℃水浴30 min,12000 r/min离心10 min后,取上清液400 μL用于酚氯仿核酸提取,最后加入100 μL灭菌的ddH2O溶解核酸,DNA含量用核酸蛋白仪测定,保证DNA的OD260/OD280比值在1.7～1.9之间。

1.2.3 羊源性荧光定量引物和探针 羊的引物和探针序列参照文献[13]进行设计,通用引物和探针的序列是根据脊椎动物线粒体DNA(16S rDNA)上的保守序列进行设计的,引物和探针均由宝生物工程(上海)公司合成,序列见表1。

表1 引物和探针的序列Table 1 Primer and probe sequences

1.2.4重组质粒的构建 PCR反应体系:2×Taq PCR Master Mix 25 μL,上下游引物(10 μmol/L)各2 μL,模板1 μL,用水补齐至50 μL。PCR反应条件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30个循环;72 ℃10 min。PCR反应结束后,取产物在2%的琼脂糖凝胶电泳。

PCR产物按照试剂盒说明书进行胶回收,将其连接到pMD-18-T载体上,转化DH5α感受态细胞做酶切鉴定,PCR鉴定为阳性的重组质粒,由生工进行测序,并命名为pMD-18-T-ovine,pMD-18-T-universal标准质粒。

1.2.5 荧光定量PCR检测方法的确定 反应体系为25 μL:2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5 μL,上下游引物0.5 μL(反应体系终浓度0.2 μmol/L),探针1 μL(反应体系终浓度0.4 μmol/L),DNA模板2 μL,其余不足用灭菌双蒸水补齐。反应循环参数为:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,58 ℃ 45 s,40个循环。

1.2.6 荧光定量PCR标准曲线的建立 分别将pMD-18-T-ovine,pMD-18-T-universal标准质粒进行10倍倍比稀释,采用荧光定量PCR进行扩增,以log(重组质粒样品稀释度)为横坐标,以对应的Ct值为纵坐标生成标准曲线,其中重组质粒标准品的拷贝数按下式计算:

拷贝数=样本浓度/样本分子量×6.02×1014

式(1)

式中,样本浓度为测定的质粒含量(ng/μL),经核酸蛋白检测仪测定后,羊和通用重组质粒的浓度分别为120.99和84.7 ng/μL;样本分子量=重组质粒长度×660。

重组质粒长度=T载体长度+目的片段长度

式(2)

式中,T载体长度为2692 bp。

1.2.7 相对定量检测体系的建立 同一份肉样的DNA分别用羊源和通用引物探针体系进行检测,测得Ct值后通过标准曲线计算出各自的拷贝数,根据拷贝数的比值计算样品中羊肉源成分占总肉成分的百分比含量,其换算公式为:

X(%)=10(Cts-C1)/k1-(Ctu-C2)/k2×100

其中,X,待检样品羊源成分占总肉成分的百分比含量(%);Cts,待检样品羊源成分引物体系PCR Ct值;Ctu,待检样品通用引物体系PCR Ct值;C1,羊源成分标准曲线截距;C2,通用标准曲线截距;k1,羊源成分标准曲线斜率;k2,通用标准曲线斜率。

1.2.8 羊源性成分荧光定量PCR检测方法的评价

1.2.8.1 灵敏度的测定 调整羊源DNA模板的初始浓度为200 ng/μL,用灭菌双蒸水进行10倍梯度稀释,以100开始,共设置100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-67个稀释度,然后分别取2 μL各稀释度的稀释液为模板,进行荧光PCR,检测引物探针的灵敏度。每个梯度重复3次。

1.2.8.2 特异性的测定 以猪、牛、鸡、羊、鸭等常见畜禽肉提取的DNA作为模板,进行实时荧光PCR反应,以验证羊源引物和探针体系的特异性。

1.2.9 制作模拟加工样品检测定量体系 针对检测体系,按照表2制备模拟样品,将羊肉样含量在90%、50%和10%时与其他单一物种进行两两混合以及多物种混合,制备各自不同模拟混合样品,提取DNA后进行定量检测。

表2 羊模拟混合肉样(w/w)Table 2 Samples of ovine mixture(w/w)

1.2.10 市售样品的检测 采用建立的羊源及通用引物探针体系对购自市场的各种肉制品样品进行检测,验证所建立的荧光定量PCR方法的适用性。

1.3 数据处理

每次试验结果重复两次,所有结果采用SPSS 17.0软件进行统计学分析,利用Excel进行图表编辑,采用FAO方法规定了统一的检测数据评价标准,即RSD≤25%。

2 结果与分析

2.1 重组质粒的鉴定

pMD-18-T-ovine,pMD-18-T-universal标准质粒的PCR鉴定结果显示羊源及通用重组质粒皆获得有效扩增(图1所示),证实各羊源和通用检测目的片段已经成功重组到质粒中。

图1 羊源及通用重组质粒PCR鉴定结果Fig.1 PCR detections of ovine and meat universal recombinant plasmids 注:M:DL2000 bp Marker;1～2:羊源引物扩增目的片段; 3～4:通用引物扩增目的片段。

2.2 重组质粒的测序结果

将初步鉴定为阳性的重组质粒进行测序。测定的序列与Genbank已知的序列进行Meglign比对,结果显示测定的基因片段序列均正确。测序结果如下:

羊重组质粒测序结果:

GCTAGAGGCAGTGCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGGAACTGTAGCCTTCTGACTCGCTCTGTTTGGCTGCCTTTCCTTCCCCGCCAGTCTCAATGGTTTTTGAGGGTTTAAAGGCATGTTGGAAT

通用重组质粒测序结果:

AGTAGAGGCAGTGCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTAGATAGAAACCGACCTGGATTACTCCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGACTTTAATCGTTGAACAAACGAACCTTTGATAGCGGTTGCACCATCGGGGTGTCCTGATCCAACATCGAGGTCGTAAT

2.3 羊源及通用重组质粒标准曲线的建立

根据式(1)～式(2)得出羊和通用重组质粒的拷贝数分别为:4.02×1010、2.82×1010copy/μL。将重组质粒10倍梯度稀释得到101～1010浓度样品,进行实时荧光PCR扩增,结果表明所建立的质粒标准品灵敏度可低至数量级为101拷贝数。

以log(重组质粒样品稀释度)为横坐标,以对应的Ct值为纵坐标生成标准曲线,具体结果分别是Y羊=-3.048x+40.67和Y通用=-3.309x+42.13,且羊和通用质粒所建立的标准曲线的相关系数分别为0.9989、0.9994,表明其直线性好,可用于准确定量。

2.4 羊源性成分荧光定量PCR检测方法的评价

2.4.1 羊源性成分荧光定量PCR检测方法的灵敏度 取10倍梯度稀释的肉源DNA各2 μL为模板,进行实时荧光PCR检测,结果如图2所示,羊源引物和探针灵敏度良好,其检测限Ct值范围控制在20～36循环之间,最低检测到羊的DNA含量为0.02 ng/μL。

图2 羊源引物探针体系灵敏度检测Fig.2 Sensitivity of ovine primer-probe system

2.4.2 羊源性成分荧光定量PCR检测方法的特异性 特异性结果显示，只有羊肉有荧光信号,其他肉样均无扩增(图3),表明所建立的方法特异性较好。

图3 羊源引物探针体系特异性检测Fig.3 Specificity of ovine primer-probe system

2.5 模拟加工样品定量检测

根据定量体系换算公式计算模拟加工样品中目的种源成分的含量,结果见表3。由表3可知，对于不同的混合样品,经统计学分析处理后,掺入量分别为90%、50%、10%的两两混合及多物种混合样品经标准曲线定量体系检测后所得的比例含量值为97.55%、58.28%、20.94%;掺入量为10%的样品测定值和真实值含量有一定偏差,相对标准偏差为49.96%,大于25%,这可能与制作模拟混合样品称量过程中的人为误差以及样品掺入量低有一定关系,而90%、50%时所得结果相对准确,也表明样品含量高时有助于定量检测的准确性,证实所建立的标准曲线定量检测体系可以应用于羊肉制品的检测。

表3 羊模拟混合肉类样品检测结果(%)Table 3 Results of quantitative detections of ovine mixture(%)

2.6 市售样品的检测

市售样品检测结果如表4所示,7份羊肉样品中有6份检出有羊源成分,其中1份羊肉卷未检出羊源成分。运用定量检测体系对其含量进行了相对的定量,发现熟羊肉和羊腿等样品的羊源性成分均在95%以上。对羊肉卷的检测发现,羊肉含量占16.75%,明显低于其包装上标明的羊肉含量54%。羊肉串样品测得的羊源成分仅为34.45%,这些结果表明市售肉制品存在掺假现象,同时证明本研究建立的方法可以应用于市售样品的初步定量,为衡量肉制品的掺杂提供依据。

表4 市售样品的定量分析Table 4 Quantitative detections of commercial samples

3 结论与讨论

肉制品掺假是食品市场中的重要问题,涉及畜牧业的健康发展、消费者权益的保障、进出口贸易等诸多领域。目前国内肉源成分PCR方法主要着眼于定性检测,但是尚不能对部分掺假的肉类食品进行定量分析,荧光定量检测多为转基因成分检测[14]、病毒[15]、细菌[16]等。苗丽等[17-18]运用微滴数字PCR方法根据肉样的质量与DNA含量的关系,以及DNA含量与拷贝数之间的关系,建立了测定肉制品的定量方法,得到了较好的效果。Cai等[19]也是运用此方法确定了猪源和鸡源性成分定量检测方法,但是数字PCR仪器昂贵,不能够较快普及市场。而部分研究仅仅是通过已知浓度系列DNA样品建立标准曲线,进而计算样品中目的DNA的含量,但是无法得知肉的具体质量百分比,对于市售样品检测的指导作用较小[7,20];沙才华等[21]通过模拟浓度标准曲线,完成了对牛源性成分的相对定量检测。Fajardo等[22]以目的肉源不同含量百分比与Ct值构成线性关系,建立马和鹿源成分的定量检测方法,取得较好的检测结果,而对于加工肉制品方面缺乏一定的研究数据。Brodamn等[23]所建立的方法与本研究较为相似,然而其仅仅是通过比较量体系的Ct值差异作为含量百分比的差异,与本研究所用的通过拷贝数之间的比值作为含量百分比是两个不同的思路。

线粒体DNA由于丰度高且在不同组织部位的含量不一致,容易导致定量结果偏差较大;而基因组DNA含量较恒定,适合用于动物源性成分的定量检测[24-25]。本研究选择单拷贝基因设计特异性引物和探针,在定量检测时更能准确地计算其拷贝数,为肉源成分定量检测研究提供方法借鉴。

本研究建立的PCR方法,特异性强,灵敏度高。利用建立的相对定量检测体系,掺入量分别为90%、50%、10%的两两混合及多物种混合样品经标准曲线定量体系检测后所得的比例含量均值为97.55%、58.28%、20.94%。掺入量为10%的样品测定值和真实值含量有一定偏差,这可能与制作模拟混合样品称量过程中的人为误差以及样品掺入量低有一定关系,而90%、50%时所得结果相对准确,在掺有相同比例羊肉的不同种类混合样品中组间差异不显著,也表明样品含量稍高时有助于定量检测的准确性,对于含量较低的掺假食品可以通过多次重复实验以减少误差。

市售样品的检测表明，该定量检测方法可以对生鲜肉、熟肉制品以及加工的肉制品进行定量检测,可满足市场中肉制品掺假制假检测需求,为肉制品日常检测及是否掺假提供有力的科学依据。