基于1H-NMR代谢组学初步比较真蜂蜜 和掺假蜂蜜差异成分

,, ,绍清,

(北京市食品安全监控和风险评估中心,北京 100041)

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露,与自身分泌物混合后,经充分酿造而成的天然甜物质[1]。蜂蜜富含多种营养物质,具有很好的保健效果及药用价值[2]。国家标准中明确规定蜂蜜是天然物质,不允许人为加入任何物质,如防腐剂、甜味剂等。但在经济利益的驱使下,蜂蜜掺假的问题由来已久,从最初的蔗糖、淀粉、饴糖掺假到后来玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、转化糖浆和大米糖浆掺假[3-4],掺杂物越来越隐形、越来越难以辨别。此外,在高品质蜂蜜中加入其它低品质的蜂蜜,以次充好的现象也屡禁不止[5]。目前,蜂蜜品质的国标检测方法包括感官鉴别、理化鉴别[1]、薄层色谱法(TLC)[6]、稳定性碳同位素比率法[7]、高效液相色谱法(HPLC)[8]等。此外,光谱分析技术、差示扫描量热分析、显微镜检测技术等[9-11]现代分析技术也被应用于蜂蜜的掺假鉴别的问题中,这些方法都存在各自的缺点,且适用范围有限[12]。蜂蜜成分复杂,其成分组成受植物源、产地、成熟程度等多方面因素的影响,仅依靠单一或是几种化学成分的被动检测,难以解决蜂蜜掺假和品质鉴定的问题,需采用非靶向的分析方法和整体的研究思路。

核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)是鉴定有机化合物结构极为重要的手段,具有前处理简单、重现性好、操作简便、结构信息丰富等优点,非常适合对蜂蜜等食品复杂体系的整体分析[13-15]。NMR结合化学计量学的方法,不仅能从模式识别的角度对食品品质进行分类分析,还能进一步寻找出引起品质差别的化学物质,从根本上打击掺假行为[16]。Spiteri等[17]采用1H-NMR结合化学计量学的方法,对麦卢卡蜂蜜和产地同为大洋洲的其他种类的蜂蜜进行了区分,并寻找到麦卢卡蜂蜜的标志性成分;Boffo等[18]采用多种NMR方法对巴西蜂蜜的成分进行了分析,并结合1H-NMR和化学计量学的方法对不同种类的蜂蜜进行了分类鉴别研究,并找出相应种类蜂蜜的标志性成分。陈雷等[19]也采用NMR结合正交偏最小二乘的方法对油菜蜜中果葡糖浆掺假进行了辨别研究;刘芸等[20]采用NMR结合化学计量学的方法建立了OPLS-DA模型用于蜂蜜的掺假鉴别,并初步寻找出区分掺假蜂蜜有显著作用的标志信号,但并未对此类信号进行定性分析。

本研究采用1H-NMR及多种2D-NMR技术结合多元统计分析的代谢组学方法对质监部门提供的国内不同产地、不同蜜源的真假蜂蜜真实样品进行了全面分析。对蜂蜜1H-NMR图谱中多种小分子有机物信号进行了归属,特别是对信号众多、化学位移相近的糖类化合物。本研究采用J-分辨结合CSSF-TOCSY的方法,对多种糖类化合物进行信号归属。在鉴别掺假蜂蜜的基础上,进一步通过相关系数负载图法寻找真蜂蜜和掺假蜂蜜样品的差异物质,对未来蜂蜜市场上蜂蜜的质量控制,规范蜂蜜的市场秩序具有重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

47个真蜂蜜样品(品种包括:洋槐蜜、椴树蜜、枇杷蜜、荆条蜜、混合花蜜、紫云英蜜、枣花蜜)和49 个掺假蜂蜜 经国内四家实验室检测判定其真伪,国家质检总局蜂蜜掺假专项;重水(氘代度:99.8%,D2O) 美国CIL公司;3-(三甲基硅基)氘代丙酸钠(纯度、氘代度:98.00%,TMSP) 美国CIL公司;5 mm核磁管 美国Norell公司;松二糖、蔗糖等标准品(纯度98.00%) 美国SIGMA公司。

Bruker AVANCE 600MHZ超导傅立叶变换核磁共振仪(配有CPBBO探头,Topspin 3.2处理软件及60 位自动进样器) 瑞士Bruker公司;BT PH调节器 瑞士Bruker公司;XS204电子天平 瑞士Mettler Toledo公司;Centrifuge 5424R离心机 德国Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品溶液的制备 称取待测蜂蜜样品1.0 g于离心管中,加入纯净水5 mL,涡旋2 min,超声(20 kHz)10 min后,10000 r/min离心10 min。取900 μL离心上清液于2 mL EP管中,加入100 μL D2O(含有1 mol/L KH2PO4和0.1%TMSP),混匀后用NaOH(或HCl)调节溶液pH=3.10。取调节好pH的液体600 μL于5 mm核磁管中,配制好的样品放置于4 ℃冰箱内保存,测试时室温25 ℃平衡30 min后上机检测。

1.2.2 样品测定及图谱处理 仪器条件:NMR仪1H载波频率为600.13 MHz,采用Bruker标准脉冲noesypr1d,检测温度为298 K,1H的90 °脉冲宽度为11.90 μs,谱宽为9014.42 Hz,中心频率为2820.01 Hz,脉冲延迟时间为4 s,扫描次数为64,空扫次数为4[9]。测得的1H-NMR谱使用Bruker Topspin3.2软件处理,变换点数为64 K,线宽因子1.00 Hz,用指数窗函数处理,基线和相位校正均采用手动方式进行,TMSP为内标信号(0.00)[9,17]。

1.2.3 蜂蜜1H-NMR图谱信号归属实验 随机抽取47种真蜂蜜中洋槐的一种按照1.2.2步骤进行样品制备,按照1.2.1上机。经过调整仪器参数、调谐、控温、匀场、采样及傅里叶变换,得到1H-NMR全图谱。采用1H-NMR、J-分辨、HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Correlation)、HSQC(Heteronuclear Singular Quantum Correlation)、CSSF-TOCSY(Chemical-Shift-Selective Filter-Total Correlation Spectroscopy)等技术,结合标准品及文献报道[21-23],对蜂蜜样品中成分的1H-NMR信号进行归属。

1.2.4 NMR定量 以TMSP为定量内标,采用核磁定量内标法对47个真蜂蜜和49个假蜂蜜样本进行定量测定[13]。

1.3 数据分析

数据标准化:处理后的图谱用MestReNova 6.0.1(Spain)软件,以δ 0.005积分段对化学位移区间δ 0.40～11.00进行分段积分并进行面积归一化处理,处理后数据存为Excel形式。

化学计量学分析:将上述所得数据导入SIMCA-p 11.0(Umetrics,umea,Sweden)软件进行主成分分析(principal componentanalysis,PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal partial leastsquares-discriminate analysis,OPLS-DA)。OPLS-DA模型采用交叉验证Q2值、排列检验对判别分析所建立的模型进行评判。

差异物质分析:对于成立的OPLS-DA模型,在对数据进行回溯转换后用Matlab(V7.0.4,Mathworks Inc.,U S A.)软件进一步绘制针对每个变量的皮尔森相关系数负载图找出组间有显著性差异的化学成分,通过查阅相关系数表,确定相关系数│r│大于0.28作为临界值(p<0.05),小于此系数忽略不计。

2 结果与分析

2.1 蜂蜜1H-NMR图谱指认

如图1所示,真洋槐蜂蜜中存在7 个有机酸(乳酸、丙氨酸、脯氨酸、柠檬酸、酪氨酸、苯基丙氨酸、甲酸),15个糖类(果糖、葡萄糖、异麦芽糖、异麦芽三塘、棉子糖、蜜二糖、麦芽酮糖、松二糖、黑曲霉二糖、麦芽三糖、潘糖、吡喃葡萄糖基蔗糖、1-蔗果三糖、曲二糖、松三糖)和2个其他类物质(乙醇、5-羟甲基糠醛)。

图1 真蜂蜜(洋槐蜜)的1H-NMR图谱Fig.1 1H-NMR spectra of the Acaci honey

糖类物质的鉴定一直是代谢物归属的难点,因为其信号众多、化学位移相近,并且与其它代谢物谱峰部分重叠[23]。为了能对这些糖类物质的特征信号进行准确归属,本研究采用J-分辨结合CSSF-TOCSY的方法[13,16],并对信号进行了确认和归属,结果见表1。糖类为蜂蜜的主要成分,占蜂蜜干物质含量的95%左右,主要包括单糖、二糖和三糖[16]。由于这些糖类的结构相似,在水溶液中存在多种构型,所以导致其在1H-NMR图谱中的信号复杂,并且重叠严重。

表1 洋槐蜂蜜样品1H-NMR图谱信号归属(pH=3.10)Table 1 Characteristics of 1H-NMR observable signals in honey samples(pH=3.10)

2.2 真蜂蜜与掺假蜂蜜差异成分分析

2.2.1 PCA分析结果 图2为真实蜂蜜和掺假蜂蜜1H-NMR图谱的PCA分析图。结果显示,大部分样品都在95%置信区间内,真实蜂蜜和掺假蜂蜜有一定的分离趋势,进一步采用有监督的模式识别对样本进行分析,找出可能的差异物质。

2.2.2 OPLS-DA分析结果 OPLS-DA是有监督的模式识别方法,它将PLS-DA与正交信号校正分析方法结合起来,过滤掉与分析矩阵中不相关的“噪音”变量,从而最大化的显现不同组别的差异性。对真实蜂蜜和掺假蜂蜜的NMR图谱进行OPLS-DA数据分析,模型前两个主成分的交叉验证Q2为78.7%。在此之后,通过排列实验随机多次(n=200)改变分类变量Y的排列顺序得到相应不同的随机Q2和R2值对模型有效性做进一步的检验,如图3所示。排列实验作为一种外部模型验证方法,主要用于验证模型的拟合度。通过随机变化改变Y变量的顺序,观察在多次随机排列Y变量的模型与原始模型Y变量模型之间的差异。

然后对随机化产生的Q2和R2与原始积累的Q2和R2值之间做回归曲线,所做回归曲线的斜率越大,与纵轴的截距越小,提示模型的预测能力越好。以模型可预测指标Q2并结合排列实验验证结果共同提示,真实蜂蜜组与掺假蜂蜜组所建模型成立,说明组间出现了显著性差异。

图4为真实蜂蜜与掺假蜂蜜的OPLS-DA模型得分图,结果显示,真实蜂蜜在第一主成分得分均小于0,而掺假蜂蜜的得分都大于0,在模型中真实蜂蜜与掺假蜂蜜能够得到很好的区分。图4中的R2X和R2Y表示的是模型中X和Y变量的平方和对数据的解释程度,Q2表示的是模型的预测能力。模型中的R2X和R2Y分别为79.6%和84.8%,Q2值为78.7%,表明模型的解释能力和预测能力均较好。通过回溯转换得到表示模型中组间差别的相关系数负载图,结果见图5。通过相关系数负载图显示出的具有显著性差异的信号,进一步通过多种NMR技术对真实蜂蜜和掺假蜂蜜的差异物质进行了结构解析,共解析出11个差异性成分,并对差异成分进行了定量分析,结果见表2。

表2 真蜂蜜与掺假蜂蜜OPLS-DA组间差异化合物及其相关系数Table 2 Compounds with significant contributions to the discrimination between pure honey and adulterated honey

图4 真实蜂蜜与掺假蜂蜜的OPLS-DA模型得分图Fig.4 OPLS-DA score plots of pure honey and adulterated honey

图5和表2显示:真实蜂蜜组中的苏氨酸、脯氨酸、松二糖、曲二糖、松三糖和苯基丙氨酸含量显著高于掺假蜂蜜组,而2,3-丁二醇、乙偶姻、甘露糖、5-羟甲基糠醛和甲酸的含量显著低于掺假蜂蜜组,表明这两组蜂蜜比较具有显著性差异(r>0.28,n=47,p<0.05)。同时,真实蜂蜜和掺假蜂蜜样品中的11种化合物含量测定结果也与相关系数的载荷图结论一致。因此,可以看出上述11 种物质的含量差异,影响着本研究中真实蜂蜜和掺假蜂蜜样本核磁代谢组学的分类。

图5 真蜂蜜与掺假蜂蜜的相关系数的载荷图Fig.5 Loading plots of correlation coefficients for pure honey and adulterated honey注:1:2,3-丁二醇;2:苏氨酸;3:乙偶姻;4:脯氨酸;5:松二糖;6:甘露糖; 7:曲二糖;8:松三糖;9:5-羟甲基糠醛;10:苯基丙氨酸;11:甲酸。

3 结论与讨论

本研究在对蜂蜜的1H-NMR图谱中24个物质的质子信号进行了归属的基础上,通过多元统计分析及相关系数负载图法比较了真蜂蜜和掺假蜂蜜样品的差异成分,并对差异性物质进行了定量测定。

结果表明,真蜂蜜组中的苏氨酸、脯氨酸、松二糖、曲二糖、松三糖和苯基丙氨酸含量高于掺假蜂蜜组,而2,3-丁二醇、乙偶姻、甘露糖、5-羟甲基糠醛和甲酸的含量低于掺假蜂蜜组,并且都具有显著性差异。

鉴别蜂蜜掺假的根本原理就是基于天然蜂蜜与掺假蜂蜜的差异,那么如何挖掘并放大天然蜂蜜与掺假蜂蜜之间的差异对于指导蜂蜜掺假鉴别具有重要的意义[4]。蜂蜜中氨基酸的主要来源是蜜源植物的花粉、花蜜及蜜蜂自身的分泌物,其种类和含量受蜜源植物影响,也与地理环境、气候等有关。研究表明,脯氨酸是大多数蜂蜜中含量最高的氨基酸,但部分蜂蜜中苯丙氨酸是主要氨基酸,其含量要高于脯氨酸,除此之外,苏氨酸在某些蜂蜜中的含量也较高[24]。松二糖、曲二糖、松三糖是蜂蜜中普遍存在的寡糖,由花蜜酿造的蜂蜜中松二糖较多,而由蜜露酿造的蜂蜜寡糖中松三糖含量更高。果葡糖浆等掺假糖浆是工业产物,其中一般不含有氨基酸及上述三种寡糖成分[25],因此,在糖浆掺假的蜂蜜中氨基酸、三种寡糖的含量应呈现下降趋势,这与我们的实验结果相符。

甘露糖是一种单糖,有研究表明,部分新鲜天然蜂蜜中含有甘露糖,但含量较低,商品蜂蜜中较少含有甘露糖[26]。但果葡糖浆在生产过程中由于葡萄糖异构酶和碱性环境的存在会导致甘露糖的产生,所占比例0.2%～1.5%。果葡糖浆掺假的蜂蜜中的甘露糖会因为糖浆的加入,使甘露糖呈现上升的趋势,这与代谢组学研究结果相符。目前,5-羟甲基糠醛可作为判断蜂蜜掺假和新鲜程度的一个指标,我国供销合作行业标准要求蜂蜜中5-羟甲基糠醛含量不得高于40 mg/kg[27]。5-羟甲基糠醛是糖在高温下脱去水分子而形成的,在制造糖浆的过程中,高温使蔗糖转化为葡萄糖、果糖,同时也会产生羟甲基糠醛,因此糖浆中会含有5-羟甲基糠醛。一般情况下,新鲜蜂蜜中是不含有5-羟甲基糠醛的,但在储存和加工过程中蜂蜜中的还原糖和含氮化合物发生美拉德反应,也会生成5-羟甲基糠醛。因此,不能单纯通过测定羟甲基糠醛的含量来鉴定蜂蜜的真伪。本研究结果中的定量数据也显示,部分真实蜂蜜的羟甲基糠醛含量要高于部分掺假蜂蜜样品。2,3-丁二醇、乙偶姻、甲酸均是蜂蜜中存在的挥发性小分子物质,其含量受蜂蜜的品种、产地、加工方式等多种因素的影响[28]。同时,糖浆在微生物的作用下也会产生上述三种物质[29]。本研究结果显示,掺假蜂蜜组的2,3-丁二醇、乙偶姻、甲酸含量高于真实蜂蜜组。

目前,国内研究者对蜂蜜1H-NMR图谱中糖类成分的指认,主要集中在对果糖和葡萄糖的信号全归属。果糖和葡萄糖是蜂蜜中的主要糖类物质,占蜂蜜总糖份的85%～95%。早期的掺假方式是以蔗糖、饴糖、淀粉掺假,这种掺假会使蜂蜜中果糖和葡萄糖的含量发生改变。但现在多是以高果糖浆、果葡糖浆等掺入蜂蜜中,由于这些糖浆中果糖和葡萄糖的比例与蜂蜜中非常相似,用它们配制出的行业内所谓的“指标蜜”的果糖和葡萄糖的比例也与真实蜂蜜相差无几。但糖浆和蜂蜜中的寡糖存在很大的区别,因此,在本研究中,采用J-分辨结合CSSF-TOCSY的方法对蜂蜜1H-NMR图谱的多种寡糖类成分信号进行了指认归属,为寻找真伪蜂蜜差异性成分奠定坚实基础,同时也为其他研究者在今后的蜂蜜真伪研究中提供可靠的数据信息。