HS-SPME条件优化并结合GC-MS 分析新鲜及不同干燥方式香菜的挥发性成分

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(山西大学生命科学学院,山西太原 030006)

香菜又叫芫荽、胡荽、延荽,为伞形科植物芫荽(CoriandrumsativumL.)的带根全草,其状似芹,叶小且嫩,茎纤细,味郁香,是常见的提味蔬菜,可用于汤、凉拌菜等,也可用于烹饪中提味,同时也是一种药用植物[1-3]。目前,有关香菜的挥发性成分研究主要是采用水蒸气蒸馏[4-8]、加压蒸馏[9]、索氏萃取[10]、超临界二氧化碳萃取法[11]和超声波法萃取[12]提取香菜精油,并对其挥发性成分进行分析。杨敏[13]用固相微萃取-气相色谱-质谱联用(SPME-GC-MS)技术分析了多种蔬菜的挥发性成分。隋华嵩等[14]用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(HS-SPME-GC-MS)技术对泰国芫荽和云南芫荽根、茎或叶中的挥发性成分进行分析,分别鉴定出40、31种化学成分。HS-SPME无需溶剂,集采样、萃取、进样于一体,灵敏度高,选择性好,能方便快捷地分离鉴定食品中的风味物质[15-16]。

近些年来,干制的蔬菜包由于体积小、质量轻、食用方便、无需冷藏、易于运输等优点,逐渐受到欢迎。目前,对香菜的干燥研究主要集中于热风干燥[17]、真空冷冻干燥[18,19]、微波干燥[20-21]等工艺的优化。Pirbalouti等[22]将伊朗香菜的茎叶经阳光干燥(19～36 ℃)、阴凉干燥(20±5) ℃、机械烤箱(40、60 ℃)、微波炉(500、700 W)以及冷冻干燥五种工艺干燥,对干燥前后通过水蒸气蒸馏萃取得到的主要精油成分进行比较,研究表明冷冻干燥对于其精油成分的影响最小。而运用HS-SPME-GC-MS对新鲜和不同干燥方式处理(烘箱干燥、红外干燥、真空干燥、真空冷冻干燥)香菜挥发性成分萃取条件优化和对比分析尚未见报道。

本实验以山西产香菜为研究对象,重点优化顶空固相微萃取条件,并采用HS-SPME-GC-MS对新鲜和不同干燥方式处理的香菜挥发性成分进行比较分析,旨在为香菜的干制提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜香菜 山西省太原市美特好超市;NaCl(分析纯) 天津市光复科技发展有限公司;C6～C40正构烷烃(色谱纯) 上海安谱科学仪器有限公司。

WS70-1型红外快速干燥箱 杭州齐威仪器有限公司;KWS1538J-F5N38L厨房家用烘焙电烤箱 广东格兰仕集团有限公司;DZF-6032真空干燥箱 上海一恒有限公司;2XZ-2单相直联旋片式真空泵 圣科仪器有限公司;LGJ-05冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;7890A-5975C GC-MS联用仪 美国安捷伦公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州长城科工贸易有限公司;65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(divinylbenzene/polydimethylsiloxane,PDMS/DVB)、75 μm碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen,DVB/CAR)、85 μm聚丙烯酸酯(Polyacrylate,PA)、100 μm聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene,PDMS)萃取头及萃取手柄 美国Supelco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备 去除新鲜香菜的根部、枯叶等,清洗干净,沥干水分,切成约30 mm左右,分别进行烘箱干燥、红外干燥、真空干燥和真空冷冻干燥处理。其中烘箱干燥的温度为60 ℃,耗时5 h;红外干燥所用红外灯的功率为550 W,物料距离灯约为15 cm,耗时2 h;真空干燥温度60 ℃,真空度0.08 MPa,耗时3 h;真空冷冻干燥温度-50 ℃,真空度100 Pa,耗时12 h;所有干燥都需将其称量至恒重才算干燥完成。恒重后,密封避光保存于干燥器中。

1.2.2 HS-SPME法提取香菜中的挥发性成分 取一定量干燥后的样品置于20 mL顶空瓶中,加入1.00 g氯化钠,用带有橡胶隔垫的瓶盖密封备用。将处理好的样品置于集热式恒温加热磁力搅拌器中,一定的萃取温度下平衡一段时间,将萃取头插入顶空瓶中萃取一段时间后,立即插入气相色谱仪进样口,在240 ℃解吸一定时间,待GC-MS分析。

1.2.3 HS-SPME法提取条件的优化

1.2.3.1 单因素实验 以新鲜香菜为原料,选取对萃取效果影响较大的因素,分别进行单因素实验,以峰个数和总峰面积为主要考察指标,研究萃取头(65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、85 μm PA、100 μm PDMS)、萃取温度(40、50、60、70、80 ℃)、样品用量(0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 g)、萃取时间(20、30、40、50、60 min)、平衡时间(10、20、30、40、50 min)、解吸时间(2、3、4、5、6 min)对萃取效果的影响。考察某一单因素时,其他固定条件为:萃取头75 μm CAR/PDMS,萃取温度70 ℃,样品用量0.80 g,萃取时间40 min,平衡时间30 min,解吸时间4 min。

1.2.3.2 正交试验设计 如表1所示的四因素三水平正交试验,确定HS-SPME分离富集挥发性成分的条件。

表1 正交试验因素水平表Table 1 The factors and levelsTable of orthogonal experiments

1.2.4 GC-MS分析条件 GC条件:HP-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);进样口温度240 ℃;载气为高纯氦气(纯度≥99.999%);流速0.8 mL/min,分流比为60∶1;柱箱升温程序:初温35 ℃,保持2 min,20 ℃/min升至80 ℃,15 ℃/min升至102 ℃,3 ℃/min升至150 ℃,7 ℃/min升至230 ℃。

MS条件:电子电离源(elector ionization,EI);电子电离能量70 eV;离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;扫描模式为全扫描,质量扫描范围33～500 m/z;质谱库为NIST 11。

1.2.5 定性与定量分析 定性:在1.2.2及1.2.3条件下对样品进行测定,其质谱图通过人工解析并与标准质谱库NIST 11相匹配,再通过C6～C40正构烷烃的保留时间计算待测物i的保留指数RI(tn

式(1)

式中:RI,保留指数;n,碳原子数;tn,碳原子数为n的正构烷烃的保留时间;tn+1,碳原子数为n+1的正构烷烃的保留时间;ti,待测物i的保留时间。

定量:根据峰面积,采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量。

1.3 数据处理

单因素实验经三次重复得到结果,采用Origin 9.1绘图;采用正交设计助手设计正交试验。极差分析、方差分析采用SAS 9.4软件。

2 结果与分析

2.1 HS-SPME提取香菜挥发性成分的条件优化结果

2.1.1 单因素实验结果

2.1.1.1 萃取头的选择 不同萃取头对萃取效果的影响结果见表2,从总峰面积来看,100 μm PDMS萃取头总峰面积最低,而其他三种萃取头的总峰面积相差不大。75 μm CAR/PDMS 萃取头萃取的挥发性成分的总峰面积最大,为6.73×108。从峰个数来看,100 μm PDMS萃取头<85 μm PA 萃取头<65 μm PDMS/DVB<75 μm CAR/PDMS 萃取头。这可能由于“相似相溶”的原理[36],非极性的PDMS萃取头对非极性物质的吸附能力较强,极性PA萃取头对极性物质的吸附力较强,由于蔬菜挥发性物质种类多而复杂,大多是弱极性或者中等极性的挥发性化合物,因此选用中等极性 65 μm PDMS/DVB 萃取头和75 μm CAR/PDMS 萃取头的效果较好。因此,本试验选用75 μm CAR/PDMS 萃取头。

表2 不同萃取头对萃取效果的影响Table 2 The effect of different SPME fiber types on the extraction

2.1.1.2 萃取温度的选择 不同萃取温度对萃取效果的影响结果见图1。从图1中可知,萃取温度从40 ℃升至60 ℃时,峰个数和总峰面积逐渐增大,增加幅度较小,继续升温至70 ℃时,峰个数和总峰面积明显增加,继续升温至80 ℃时,峰个数明显减少。这是由于温度过低,萃取头吸附的组分较少,峰面积较低;随着萃取温度的升高,待测组分扩散速度增大,蒸气压增大,从而有利于萃取的进行[37];而当萃取头吸附量达到饱和时,继续升高温度使萃取头吸附量减少,使吸附能力较强的组分的量增加,吸附能力相对较弱的组分的量减少,甚至大峰会把小峰掩盖,致使峰个数减少,萃取能力降低,总峰面积下降。因此,萃取温度选为70 ℃。

图1 不同萃取温度对萃取效果的影响Fig.1 The effect of different extraction temperatures on the extraction

2.1.1.3 萃取时间的选择 在其他条件不变的前提下,固相微萃取纤维头在顶空瓶内达到吸附与解吸的动态平衡时有最大吸附量[38]。图2表明,萃取时间在20～40 min之间时,随着萃取时间的增加,峰个数和总峰面积逐渐增加;当萃取时间达到40 min时,峰个数达到最多;再延长萃取时间,峰个数减少,总峰面积均缓慢增加。这是由于萃取开始时,挥发性组分易富集,吸附量增加较快;随着萃取时间的增加,有利于达到萃取平衡,但时间过长,会使各组分间竞争吸附,导致小分子组分脱附。因此萃取时间选择为40 min。

图2 不同萃取时间对萃取效果的影响Fig.2 The effect of different extraction time on the extraction

2.1.1.4 样品用量的选择 由图3可看出,随样品用量的增加,总峰面积逐渐增加,当样品用量为0.80 g时其值最大;当样品用量0.20～0.60 g之间时,随样品用量增加,峰个数逐渐增加,而在0.60～1.00 g之间,峰个数无明显变化。这是由于样品用量较少时,待测组分强度较低,且数量较少;样品用量较大时,从基质挥发出来的组分增加,吸附能力较强组分的量不断增加,萃取头的吸附量略微增加。因此样品用量选为0.80 g。

图3 不同样品用量对萃取效果的影响Fig.3 The effect of different sample amounts on the extraction

2.1.1.5 平衡时间的选择 由图4可知,平衡时间为10～30 min时,随着平衡时间的延长,峰个数和总峰面积逐渐增大,平衡时间为30 min时均达到最大;平衡时间继续延长,峰个数和峰面积均有所降低。这是由于平衡过程中,平衡时间增加,萃取头吸附的挥发性组分逐渐达到饱和。因此平衡时间选为30 min。

图4 不同平衡时间对萃取效果的影响Fig.4 The effect of different equilibrium time on the extraction

2.1.1.6 解吸时间的选择 解吸时间决定着挥发性组分的解吸程度,解吸时间过短,各组分解吸不完全,GC-MS分析结果准确性下降;解吸时间过长,可能会导致萃取纤维头上部分组分分解,故需选择合适的解吸时间[37]。从图5可知,解吸时间为4 min时,峰个数和总峰面积最大,萃取效果最好。因此解吸时间选为4 min。

图5 不同解吸时间对萃取效果的影响Fig.5 The effect of different desorption time on the extraction

2.1.2 正交试验结果 因不同解吸时间和平衡时间对应的峰面积和峰个数变化幅度较少,而萃取头种类、萃取温度、萃取时间及样品用量对萃取效果有较大影响,所以在单因素实验的基础上,考察了萃取头、萃取温度、萃取时间、样品用量(g)对萃取效果的影响,设计了四因素三水平的正交试验。正交试验结果如表3所示。

表3 正交试验设计结果Table 3 The results of orthogonal experiment

由表3可知,当以峰个数为考察指标时,各因素对萃取效果的影响顺序为:A>B>C>D,即萃取头种类>萃取温度>萃取时间>样品用量,较优组合为A2B2C2D3。当以总峰面积为考察指标时,各因素对萃取效果的影响顺序为A>B>D>C,即萃取头种类>萃取温度>样品用量>萃取时间,较优组合为A2B2C2D3。由以上结果可知,萃取头种类对萃取效果影响最大,萃取温度次之。

经统计学软件SAS 9.4的方差分析结果(表4)可知,从峰个数和总峰面积来看,萃取头、萃取温度、萃取时间对结果都有极显著的影响(p<0.01);但是从峰个数来看样品用量对结果的影响不显著(p>0.05)。

表4 方差分析结果Table 4 Results of analysis of variance

经试验验证,较优组合A2B2C2D3,峰个数为58,总峰面积为8.412×108,均比正交表中最大峰个数和总峰面积组合A2B2C3D1大,最终确定最优组合为A2B2C2D3,即选用75 μm CAR/PDMS萃取头,萃取温度70 ℃,样品用量1.00 g,萃取时间40 min。

2.2 不同干燥方式香菜挥发性成分分析

对新鲜和不同干燥方式处理的香菜,按照1.2.2和1.2.3条件进行测定,其总离子流色谱图如图6～图10所示,挥发性成分种类及相对含量结果见表5。

表5 新鲜及不同干燥处理的香菜挥发性成分的GC-MS分析结果Table 5 GC-MS analysis results of volatile compounds in fresh and different drying coriander

续表

续表

图6 新鲜香菜挥发性成分总离子流色谱图Fig.6 Total ion current chromatogram of volatile compounds from fresh coriander

图7 烘箱干燥的香菜挥发性成分总离子流色谱图Fig.7 Total ion current chromatogram of volatile compounds from coriander subjected to oven drying

图8 红外干燥的香菜挥发性成分总离子流色谱图Fig.8 Total ion current chromatogram of volatile compounds from coriander subjected to infrared drying

图9 真空干燥的香菜挥发性成分总离子流色谱图Fig.9 Total ion current chromatogram of volatile compounds from coriander subjected to vacuum drying

图10 真空冷冻干燥的香菜挥发性成分总离子流色谱图Fig.10 Total ion current chromatogram of volatile compounds from coriander subjected to vacuum freeze-drying

2.2.1 新鲜香菜挥发性成分分析 新鲜香菜共分离得到58种组分,鉴定出结构的有52种,占香菜总挥发性成分的99.57%,其中醛类和醇类含量较高,占总组分的97.06%,是新鲜香菜的主要风味组分。醛类(21种)占总组分的72.52%,而2-十二烯醛、2-十四烯醛、癸醛、(E)-2-癸烯醛、十二醛、(E)-2-十三烯醛和(E)-2-十六烯醛的含量较高,占总醛含量的94.14%,是新鲜香菜中醛类的主要组成部分;醇类(12种)占总组分的24.54%,而癸醇、2-癸烯醇和2-十二烯醇的含量较高,占总醇含量的90.14%。

隋华嵩等发现[14],泰国和云南香菜的主要挥发性成分是醛类和醇类,本文研究结论表明香菜主要挥发性成分是2-十二烯醛和2-十四烯醛,与文献结果相一致。而杨敏[13]用SPME-GC-MS分析香菜挥发性成分主要也为醛类和醇类,但其醛类中4-十七烯醛含量较高;兰州芫荽中烯醇类物质含量较高,尤其是Z-十二烯醇含量最高,其次是十三醇和顺-2-甲基环戊醇;报道未见香菜中含有2-甲基硫醚,而本实验山西产香菜中检出2-甲基硫醚,但含量较低。可见,不同产地芫荽挥发性成分及其含量均存在较大差异。

2.2.2 新鲜与不同干燥处理香菜挥发性成分比较 据表5可知,从检出的挥发性成分的总个数来看,红外干燥(38种)<真空干燥(40种)<烘箱干燥(43)<真空冷冻干燥(53种);醛类:真空干燥(15种)<烘箱干燥、真空冷冻干燥(19种)<红外干燥(21种);醇类:红外干燥(3种)<真空干燥(6种)<烘箱干燥(8种)<真空冷冻干燥(11种);烃类:红外干燥(9种)<烘箱干燥(11种)<真空干燥(14种)<真空冷冻干燥(16种);酯类:红外干燥、真空干燥(1种)<烘箱干燥、真空冷冻干燥(2种);其他化合物:烘箱干燥(3种)<红外干燥、真空干燥(4种)<真空冷冻干燥(5种)。因此,从检出的挥发性成分的个数来看,除醛类为红外干燥检出的个数最多,其他均是真空冷冻干燥检出的个数最多;而烘箱干燥和真空干燥介于两者之间。总体来看,醛类、醇类和烃类检出的个数较多,可能对其风味有重要作用。

从检出的各类挥发性成分含量来看,醛类为:真空冷冻干燥(44.85%)<真空干燥(60.81%)<烘箱干燥(66.21%)<红外干燥(84.66%);醇类:红外干燥(7.84%)<烘箱干燥(21.95%)<真空干燥(24.47%)<真空冷冻干燥(43.05%);烃类:红外干燥(4.65%)<真空冷冻干燥干燥(6.73%)<烘箱干燥(8.36%)<红外干燥(11.42%);酯类:红外干燥(0.14%)<烘箱干燥(0.18%)<真空干燥(0.34%)<真空冷冻干燥(0.68%);其他化合物为:烘箱干燥(1.64%)<红外干燥(2.30%)<真空干燥、真空冷冻干燥(2.39%)。总之,红外干燥中检出的醛类和烃类的含量最多,真空冷冻干燥在醇类、烃类、酯类及其他化合物中含量均为最大。在这四种干燥方式中,醛类和醇类两者的含量相加均高于85%,这说明醛类和醇类可能对其风味有很大的决定作用。

新鲜、烘箱干燥、红外干燥、真空干燥、真空冷冻干燥香菜共有的挥发性成分有24种,分别占各自总含量的92.52%、94.26%、96.12%、94.9%、85.23%,说明新鲜与不同处理的香菜在主要挥发性成分的种类上相差较小,而在含量上有所差距。其中共有的醛类有12种,为乙醛、苯甲醛、壬醛、癸醛、(E)-2-癸烯醛、十一醛、2-十一烯醛、十二醛、2-十二烯醛、十三醛、十四醛、十五醛。其中在新鲜、烘箱干燥、红外干燥、真空干燥、真空冷冻干燥中,十二醛的含量分别为4.27%、6.34%、7.65%、10.92%、7.22%,(E)-2-癸烯醛的含量分别为4.61%、6.75%、4.60%、1.43%、1.82%,癸醛的含量分别为11.72%、18.43%、18.73%、37.32%、14.54%,2-十二烯醛的含量分别为20.36%、10.69%、21.49%、4.01%、3.21%。而新鲜香菜中含量较高的为癸醛、2-十二烯醛和2-十四烯醛;红外干燥与新鲜香菜各物质的含量较为接近;烘箱干燥和真空冷冻干燥均为癸醛含量较高,而2-十二烯醛和2-十四烯醛的含量比新鲜香菜低;真空干燥中癸醛含量最高,不含2-十四烯醛,而含有较高量的十二醛,与新鲜香菜相差较大。

新鲜与不同处理的香菜共有的醇类有3种,分别为(E)-2-癸烯醇、癸醇和反式-2-十二烯醇;其中在新鲜、烘箱干燥、红外干燥、真空干燥、真空冷冻干燥中,(E)-2-癸烯醇的含量分别为5.51%、5.03%、0.86%、2.17%、8.06%;癸醇的含量分别为11.54%、10.28%、3.26%、14.06%、17.26%;反式-2-十二烯醇的含量分别为5.07%、4.68%、3.72%、5.60%、11.11%。从中可以看出,烘箱干燥与新鲜香菜在这3种醇的含量上较为相近;而真空冷冻干燥这3种醇的含量均高于新鲜香菜。共有的烃类有7种,分别为壬烷、癸烷、十一烷、顺式蒎烷、γ-萜品油烯、γ-榄香烯和大根香叶烯。真空干燥中壬烷、顺式蒎烷的含量较高,为3.98%、5.83%;新鲜香菜中烃类的含量较低,而四种干燥方式中红外干燥中烃类的含量较小。共有酯类有1种,为邻苯二甲酸二异丁酯,含量均低于0.5%。其他共有化合物中有1种,为二甲基硫醚,其在新鲜中相对含量较低为0.17%,而在烘箱干燥、红外干燥、真空干燥、真空冷冻干燥中的含量分别为1.35%、1.63%、2.04%和1.49%。真空干燥中二甲基硫醚的含量最高,对食品香精的香气有显著影响。此外,不同干燥处理香菜中共有的挥发性成分3-甲基-丙醛、2-甲基-丁醛和3-甲基-丁醛,但各自含量均低于0.50%。烘箱干燥中含量较小的癸酸乙酯可用于食品、香皂及花香型香精的调香剂。红外干燥中含量较低的糠醛(0.27%)类似面包和焦糖的香味[39],这些微量成分和主成分共同协调给予香菜令人愉快的香气。

从干燥成本来说,真空冷冻干燥需首先进行预冻,利用较高真空下将冰升华转变为蒸气而除去的原理进行干燥,所需设备要求较高,工业生产成本较大,且装载量有限,耗时最长,红外耗时最短。

3 结论

采用HS-SPME-GC-MS分析新鲜香菜的最优HS-SPME参数为:75 μm DVB/PDMS萃取头,萃取温度70 ℃,样品用量1.00 g,平衡时间30 min,萃取时间40 min,解吸时间4 min。醛类和醇类为新鲜香菜的主要风味成分,主要是2-十四烯醛、2-十二烯醛、癸醛、癸醇、(E)-2-癸烯醇、反式-2-十二烯醇、(E)-2-癸烯醛和十二醛、(E)-2-十六烯醛和(E)-2-十三烯醛。从检出的挥发性成分的个数来看,红外干燥检出的醛类个数最多;除醛类外,其余均是真空冷冻干燥检出的个数最多;而烘箱干燥和真空干燥介于两者之间。从各种挥发性成分的含量来看,红外干燥检出的醛类和烃类最多,醛类占70%以上,且与新鲜香菜中含量较高的癸醛、2-十二烯醛和2-十四烯醛含量较为接近;真空冷冻干燥在醇类、烃类、酯类及其他化合物中均含量最大;而醛类和醇类两者的相加含量高达85%以上,是主要的风味成分。从干燥成本来说,红外干燥所需时间最短,耗能较小;而真空冷冻干燥所需时间长,能耗大,成本较高。因此综合考虑可以采取红外干燥。