氧化应激细胞模型建立的研究进展

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(四川大学华西公共卫生学院(华西第四医院),四川成都 610041)

氧化应激是指在体内外有害因素刺激下,体内自由基增加或机体抗氧化保护能力减弱,导致氧化系统和抗氧化系统失衡[1]。在此状态下,过多积累的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)会造成核酸、蛋白质和脂质等生物分子的损伤,进而可能导致心血管疾病、阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森氏症(Parkinson’s disease,PD)等慢性退行性疾病的发生和发展[2]。抗氧化剂可通过中和自由基、清除氧化剂或防止氧化剂转变为毒性更强的化合物,减缓或抑制细胞损伤,达到抗氧化的目的[3]。因此,研究有害因素引起氧化应激的机制,评价并筛选有效的抗氧化剂,为抗氧化功能性食品的研发提供方向,对维护机体健康和预防控制疾病有重要意义。

目前,研究氧化应激和抗氧化的方法主要包括化学法、动物模型法和细胞模型法。化学法虽然快速,但仅用单一的化学反应无法反映体内复杂的生理过程和作用机理。动物模型法能真实模拟体内环境,但却存在周期长、价格昂贵等缺点。细胞模型法是以应激源处理细胞,破坏细胞内正常的氧化还原状态,通过产生能损伤DNA、RNA、蛋白质、脂质等细胞内成分的物质,发挥毒性作用,模拟机体内氧化应激状态[4],因此可有效反映有害物质、抗氧化剂在细胞内的吸收、代谢和利用情况,准确模拟生物体内环境,还可根据研究目的挑选最佳的细胞株建立模型,既可研究体内外有害物质对细胞的氧化损伤效果和机制,也可有效评价或筛选抗氧化剂。然而,目前总结氧化应激细胞模型方法的文献报道较少。因此,本文从细胞株的挑选、应激源的选择、模型判断指标等方面,对建立氧化应激细胞模型的方法进行综述,并从化学、物理和生物等方面对应激源进行了分类总结,旨在为后续的有害物质氧化应激损伤评价、抗氧化剂筛选等研究提供参考。

1 氧化应激细胞株的选择

选择合适的细胞是成功构建细胞模型的关键,细胞本身的性能特点和生长状态都是评价抗氧化活性的影响因素,且细胞对物质的反应程度会受到成分、暴露剂量和时间等多方面的影响。故需根据待评价的有害物质或抗氧化剂的作用靶点和机制来选择适宜的细胞株,才能建立可准确反映作用效果的细胞模型。

本文从机体不同的功能系统,对当前研究中常使用的细胞株进行总结,见表1。根据研究目的的不同,可选择目的器官或系统相对应的细胞株构建模型,以达到最佳的建模效果。少数细胞株所具有的特殊生理特性,使得其可应用于与其来源系统不同的其他方向。PC12细胞株虽来自鼠肾上腺嗜铬细胞瘤,但由于其可分化为具有交感神经元特性的细胞,常用于神经系统疾病的相关研究[5-6];来源于人胚胎肾细胞的HEK293易于生长和转染,不仅能评价氧化应激对肾脏造成的损伤[9],更广泛用于通过转基因技术构建可表达外源基因的氧化应激细胞模型[10]。然而,对于绝大多数细胞株来说,仍保留其来源系统正常细胞的特征,因此普遍应用于相应系统的氧化应激研究。例如,炎症、过敏反应等免疫系统相关研究可采用免疫细胞来源的RAW264.7小鼠巨噬细胞系或大鼠嗜碱性白血病细胞系(RBL-2H3)建模[11-12];而骨质疏松细胞模型的构建,则选择具有成骨细胞特点的人成骨肉瘤MG63细胞株和小鼠成骨样细胞株MC3T3-E1[13-14]。

表1 氧化应激细胞模型常用细胞株及其细胞模型的应用Table 1 Frequently-used cell lines and applications of cellular oxidative stress model

需要注意的是,细胞体外培养环境与其在体内的生长环境存在差异,不同实验室间的研究结果也不尽相同,因此建立标准化的细胞模型体外培养体系,才能提高不同研究结果间的可比性。

2 氧化应激细胞模型应激源的选择

应激源的选择需考虑研究目的,研究某种物质的氧化损伤效果,则选择该物质作为构建细胞模型的应激源;若要评价抗氧化剂的抗氧化活性,则应根据该抗氧化剂的作用靶点和机制选择应激源,或直接选择常用的应激方法。本文对当前研究中使用的应激源进行总结,并分为以下几类。

2.1 化学类应激源

化学类应激源种类较多,其中过氧化氢(H2O2)最为常见,它作为一种ROS,能抑制细胞增殖,造成细胞内大分子的氧化损伤,最终导致细胞衰老、死亡和突变等严重后果。因此,H2O2诱导的氧化应激细胞模型普遍用于探究自由基介导的细胞损伤机制及抗氧化剂对氧化损伤的保护和修复机制[22]。

部分具有神经毒性的化学物质,可应用于神经性疾病的研究。1-甲基-4-苯基吡离子(MPP+)作为神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)在体内的代谢产物,可抑制线粒体复合物Ⅰ并引起ROS的过量产生,从而引起细胞内氧化应激和细胞凋亡,故常用于建立PD细胞模型[23]。6-羟基多巴胺(6-OHDA)也是一种神经毒素,它能选择性损伤多巴胺能神经元,一旦进入神经元,6-OHDA积累并经过非酶的自动氧化,促进ROS的形成[24],因而Liu等[25]以6-OHDA构建PD细胞模型,评价大蒜素是否能通过抑制氧化应激和线粒体功能紊乱,对PD相关神经损伤起到保护作用。此外,谷氨酸盐是一种兴奋性神经传导物质,利用谷氨酸盐兴奋性中毒的原理,可直接用谷氨酸盐诱导PC12细胞的凋亡,构建由缺血引起神经损伤的细胞模型,探索大脑局部缺血的机制[26]。

一些化学物质可以作为自由基引发剂,在自由基反应中能产生自由基,因此也可作为应激源。2,2-偶氮二(2-甲基丙基脒)二盐酸盐(AAPH)是一种小分子偶氮引发剂,可诱导过氧自由基的生成,通过细胞氧化损伤导致机体各种病理改变,因此AAPH作为自由基产生源,常用于红细胞、血浆和全血等的抗氧化活性研究[27]。叔丁基过氧化氢(t-BHP)也是一种常用的自由基反应引发剂,可作为评价细胞和组织氧化应激机制的助氧化剂,周曦等[28]以t-BHP建立HUVEC模型,研究白藜芦醇对HUVEC氧化应激损伤的抑制作用和机制,发现白藜芦醇可能通过活化SIRT1抑制UCP2表达,削弱t-BHP诱导的细胞内ROS生成,从而抑制细胞氧化应激损伤。

此外,药物也可用于氧化应激细胞模型的构建,例如,阿霉素(Doxorubicin,DOX)是一种有效的化疗药物,但会引起心动过速、心律不齐、低血压等各种心脏毒性,氧化应激是DOX引发心肌损伤的关键因素,这是由于DOX能产生大量的超氧阴离子自由基,从而引发线粒体功能障碍和细胞损伤。故Zhao等[29]以DOX诱导H9c2细胞建立氧化应激细胞模型,发现薯蓣皂苷对DOX引起的心脏毒性有抑制作用,并阐明薯蓣皂苷是通过调节miR-140-5p介导的心肌氧化应激,来减轻DOX引起的心脏毒性。

总而言之,化学类应激源种类繁多,不仅有外源性氧化剂和神经毒素,还包括对机体有毒性作用的药物,选择多,易获取,在氧化应激细胞模型构建中应用广泛。

2.2 物理类应激源

物理类应激源主要包括紫外照射、辐照和空气颗粒物等,其来源于外部环境,并会对机体造成氧化损伤。紫外线照射是导致皮肤光老化的主要原因,杨清建等[30]采用UVB体外照射模拟皮肤成纤维细胞的光老化,研究肝细胞生长因子对抗ROS的作用。随着移动通信系统的发展和手机的广泛使用,人们越来越关注手机辐射的潜在危害,Hou等[31]将小鼠胚胎成纤维细胞系间歇暴露于1800 MHz的GSM-talk模式的电磁辐射中,以评价其对细胞的氧化损伤作用。PM2.5诱导的氧化应激是其发挥毒性作用的重要分子机制,故Deng等[32]以PM2.5建立细胞模型,探究细胞内PM2.5相关的抗氧化防御机制。

另外,石棉、除草剂等建筑业或农业常用材料,广泛存在于外界环境并危害人体健康,为研究相关药物对它们所引起氧化损伤的抑制作用,可直接用石棉或除草剂处理细胞,构建氧化应激细胞模型[33-34]。

2.3 生物类应激源

生物类应激源主要包括基因工程技术和体内代谢产物。基因工程方法常见于AD相关研究,AD的病理学标志是细胞外淀粉样蛋白斑,它的形成是由于淀粉样前体蛋白(APP)基因突变,使APP更易被β-分泌酶和γ-分泌酶水解,导致分解产物淀粉样蛋白40(Aβ40)和Aβ42的非正常积累与沉积[35]。故采用病毒转染或质粒转染技术,将合成的APP变异基因(APPswe)转染到SH-SY-5Y细胞上,构建APP蛋白过表达的AD细胞模型[36],也可直接将携带瑞典突变APP基因的Hek293细胞(Hek293-APPswe)作为AD的转基因细胞模型[37]。

体内的某些代谢物会对细胞、组织等造成损伤,因此也常将这些代谢物用作应激源构建体外细胞模型。例如,曹慧敏等[38]以氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)建立细胞模型,发现丹参酮ⅡA能上调ox-LDL诱导的HUVEC氧化应激模型的自噬,保护细胞氧化应激损伤;AD细胞模型的构建除采用转基因技术外,还可直接用Aβ1-40或Aβ1-42处理PC12等细胞以构建细胞模型,进而研究抗氧化剂对AD的抑制效果[39]。

人为的选择与疾病相关的应激源,体外模拟氧化应激,能反映抗氧化剂在机体病理状态下的作用机制。但鲜有研究对比不同应激源引起的细胞氧化损伤的差异,因此在今后的研究中,可使用多种应激源对细胞造成不同程度的氧化损伤,从而进一步比较抗氧化剂对细胞损伤的保护作用。

3 氧化应激细胞模型的模型判断指标

要成功建立氧化应激细胞模型,在应激源处理细胞后,还需检测细胞损伤情况,评价应激源是否引起细胞的氧化损伤,及损伤程度的大小,以选择最佳的造模条件。常用的检测指标主要通过细胞存活率、细胞内ROS水平、脂质过氧化物和抗氧化酶类等四个方面进行评价。

MTT法和CCK-8法是常用的评价细胞存活率的方法,CCK-8法测定的准确度和精确度均高于MTT法,且该法操作简便快速,对环境的危害小,因此,在构建氧化应激细胞模型时,应推广以CCK-8法检测细胞存活率[40]。细胞内总ROS水平多采用二氯荧光素二乙酸酯探针(DCFDA)法测定,它是评价细胞氧化应激程度最直接的指标[41]。脂质过氧化产物可通过攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸,从而造成细胞损伤,因此可直接反映氧化损伤,在细胞模型中常用的指标是丙二醛(MDA),采用硫代巴比妥酸(TBARS)法进行检测[42]。另外,抗氧化相关酶类能间接反映细胞内的抗氧化反应,例如谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等,它们能将自由基转化为非毒性形式,是细胞内抗氧化防御系统重要的组成部分,影响着体内氧化和抗氧化作用之间的动态平衡[43],这些酶类数量的增减可反映细胞内的氧化状态,故常将抗氧化酶类的活性作为构建氧化应激细胞模型时的检测指标。

细胞存活率和细胞内ROS水平是筛选造模条件的关键指标,最佳的造模条件需满足在该应激源处理浓度和诱导时间下,既能使细胞内的ROS水平显著增加,又能最大限度地减少对细胞的伤害[44]。在实际研究中,通常会设立多个应激源浓度或强度、不同的作用时间,综合考虑不同条件下各指标的差异来选择最佳造模条件。若在某一条件下,模型组细胞内ROS水平与正常对照组细胞内ROS水平相比明显增高,差异具有统计学意义,同时模型组细胞存活率与对照组相比没有显著降低,另外若模型组的MDA、SOD、GSH-Px等发生显著变化,说明应激源已引起氧化应激,且细胞内脂质和酶系均发生显著改变,即可认为造模成功。

4 结语与展望

氧化应激细胞模型广泛应用于评价体内外有害物质对细胞、组织的氧化损伤作用,并用于筛选有效的抗氧化剂。相比于动物模型法和化学实验法,细胞模型法有快捷、经济的优势,还能模拟体内环境。此外,细胞模型法的评价机制灵活,可供选择的细胞株和应激源种类多,基因工程技术也可用于细胞模型的构建,研究人员可根据研究基础和目的,选择适宜的细胞株和应激源建立氧化应激细胞模型,从而对有害物质的氧化损伤作用、抗氧化剂的抗氧化活性作出更加准确的评价。然而,细胞模型法也存在不足之处,比如一些通过膳食补充的抗氧化剂是成分复杂的混合物,须经消化道消化后才能被机体吸收并到达靶细胞发挥作用,这是一个复杂的过程,机体内不同细胞间会相互影响,因此针对单一靶细胞的实验结果与抗氧化剂进入机体发挥作用的实际情况有较大差别。

由于氧化应激细胞模型的多种多样,在研究中,要构建最佳的细胞模型存在一定的难度;且目前还没有标准化的抗氧化细胞模型评价体系和指标检测手段,各实验室研究结果难以进行统一比较。因此,研究并建立一套标准化的、完整的氧化应激细胞模型评价体系是未来发展方向,同时,还应通过不断优化和改进,使未来的细胞模型评价体系更加经济高效、安全低毒。