0.2%二氢卟吩铁可溶粉剂HPLC测定方法不确定度评估

曹 磊

（国家农药产品质量监督检验中心 （南京），江苏 南京 210007）

测量不确定度是表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数。评定不确定度是分析工作最基本也是最重要的指标，是反映检测全过程的重要标志。不确定度评定作为测试和校准方法及方法验证的一个重要技术，要求实验室应建立并实施测定不确定度的评价程序。若检测结果处于标准限量的临界值时，必须给出不确定度以满足对检测结果进行评判，让客户从测量结果了解测定数据的离散程度。

二氢卟吩铁是从蚕沙中提取的具有调节作物生长的家型天然植物生长调节剂，主要作用为调节作物生长，对抗逆和产量都有较好的增收作用。其作用机理是通过抑制叶绿素酶而缓解叶绿素的降解，提高叶绿素含量，并提高光系统Ⅱ （PSⅡ） 的最大光化学效率 （Fv/Fm），能够促进根细胞内NO的生成和降低吲哚乙酸氧化酶的活性，促进植物根系生长；明显提高活性氧清除酶活性，促进抗氧化物脯氨酸含量升高。经室内活性试验和田间药效试验，结果表明0.02%二氢卟吩铁可溶粉剂对油菜生长有较好的调节活性，能够增加单株角果数，每角粒数，千粒重等[1]。本文研究了液相法测定二氢卟吩铁含量过程中不确定度的评定与表示方法，具有借鉴及参考意义。

1 实验方法

1.1 仪器及试剂 Agilent 1260 高效液相色谱仪；250mm×4.6mm （i.d） 不锈钢柱，内装Agilent ZORBAX SB-C18，5μm填充物；电子分析天平 （XS105DU 型，METTLER TOLEDO）；超声清洗仪 （KQ-300E）；甲醇 （含量99.9%，色谱纯）；磷酸 （含量 99.5%，分析纯）；家蒸二次蒸馏水 （18.2MΩ·cm，Milli-Q）；二氢卟吩铁标样 （纯度93.0%，国家农药质检中心（沈阳） 提供）；0.02%二氢卟吩铁可溶粉剂（企业提供）。

1.2 色谱条件 流动相：甲醇+磷酸水溶液（pH2.0）=50 +50 （v/v）；流速：1.0mL/min；柱 温：25℃；检 测 波 长：392nm；进 样 体积：5μL；

图1 标准品色谱图

1.3 实验步骤

1.3.1 标准物质溶液的配制 称取0.05g二氢卟吩铁标样 （精确至0.000 2g），置于50mL容量瓶中，加甲醇后超声使溶解，冷却至室温后用甲醇稀释至刻度后摇匀过滤即得；

1.3.2 样品溶液的配制 称取6g试样 （精确至0.000 2g），置于 50mL容量瓶中，加甲醇后超声使溶解，冷却至室温后用甲醇稀释至刻度后摇匀过滤即得；

1.3.3 按照连续5 针标样溶液、连续5 针样品溶液的顺序进样；

1.3.4 计算 试样中二氢卟吩铁的质量分数ω1（%） 按右式计算：

式中：

A2——试样溶液中，二氢卟吩铁峰面积的平均值；

A1——标样溶液中，二氢卟吩铁峰面积的平均值；

m1——标样的质量，单位为克 （g）；

m2——试样的质量，单位为克 （g）；

w——二氢卟吩铁标样的质量分数，以%表示。

标准品及样品的典型色谱图 （图1 及图2）：

图2 样品色谱图

2 检测方法不确定度评定

2.1 不确定度的来源 以二氢卟吩铁质量分数计算公式为数学模型，可得出不确定度分量来源包括：标准物质纯度、标准物质称量及配制、样品称量及配制、标准物质及样品测量的重复性。

2.2 标准物质纯度引入的不确定度 根据标准物质证书中提供的信息，二氢卟吩铁纯度为93.0%，不确定度为 ±0.2%，属于B类评定。按正态分布[2]，取置信水准为95%，K=2，则有：U1=0.2/（2 ×93.0）=1.08 ×10-3；

2.3 标准物质称量引入的不确定度 查称量所使用的电子天平检定证书，其最大允许误差为±0.1mg，属于 B类评定，按正态分布[1]，取置信水准p=99%，K=3，则标准不确定度为：U2=0.1mg/3=0.033 3mg，标准物质重复称量2次，称样量为0.051 2 g，则其相对不确定度为；

2.4 标准物质溶液配制引入的不确定度

2.4.1 50mL容量瓶引起的体积不确定度 容量允许误差为 ±0.05mL[3]，B类不确定度评定：；

2.4.2 溶液温度与校准时温度不同引起的体积不确定度 假设溶液与校准温度的差异为±5℃，容量瓶体积为50mL，甲醇的体积膨胀系数为1.2 ×10-3/℃，玻璃的膨胀系数为 2.5 ×按矩形分布，取则由校准和使用温度不同引起的容量瓶体积不确定度为：

2.5 样品称量引入的不确定度 参考2.3 所述，样品重复称量2 次，称样量为6.584 5g，则其相对不确定度为10-6；

2.6 样品溶液配制引入的不确定度 参考2.4所述，样品溶液配制引入的相对不确定度即3.44 ×10-3；

2.7 标准物质及样品测量峰面积的重复性引入的不确定度 标准物质溶液及样品溶液均重复进样5 次，峰面积 （表1）：

表1 峰面积测量结果

标准物质峰面积测量重复性引入的相对不确定度为

样品峰面积测量重复性引入的相对不确定度为

3 合成相对不确定度的评定

综合上述各不确定分量，得出合成相对不确定度

本次实验测得0.02%二氢卟吩铁可溶粉剂中二氢卟吩铁含量为0.021%，则

4 扩展不确定度的评定

按95%置信概率，取包含因子K=2，则扩展不确定度

故本次采用高效液相色谱法测定0.02%二氢卟吩铁可溶粉剂中二氢卟吩铁含量为 （0.021±0.000 2）%。

5 结论

5.1 在不确定度的评估过程中，标准物质含量和标样及样品溶液配置、定容操作引入的不确定度占主导地位；

5.2 本试验最终扩展不确定度的评定结果在符合上述方法和条件的规范化测量情况下可直接引用；

5.3 若按双平行样双针进样，按照本文所述依次计算各步骤不确定度分量、合成不确定度及扩展不确定度即可。