猕猴桃溃疡病菌的田间分布及其传播规律

李亚巍， 王小洁, 吴 群， 李士谣， 李双荣， 朱立武， 刘 普

(1. 安徽农业大学 园艺学院， 合肥 230036; 2. 安徽大学 生命科学学院， 合肥 230601; 3. 浙江省衢州市经济特产站， 衢州 324002)

猕猴桃(ActinidiaLindl)是20世纪以来驯化的一种新兴藤本果树。我国为猕猴桃属植物的分布中心和主产国，猕猴桃在我国自然界中分布广，其经济价值高，果实营养丰富，特别是膳食纤维和维生素C含量较高[1]。

猕猴桃溃疡病(Bacterial canker of kiwifruit)是由丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidiae, Psa)引起的检疫性细菌病害，主要危害猕猴桃的叶片、枝蔓和主干等。猕猴桃溃疡病菌属于典型低温型病害，病菌最适的发病温度为20℃以下，病菌GFPuv标记的研究结果显示4℃下病菌可以快速在组织中扩散蔓延，25℃侵染速度明显减缓[2]，因此病菌在周年中呈现出两次发病高峰[3]。该病菌同时还具有发生范围广、传播迅速、致病性强和防治难度大等特点，极易在短期内造成大面积树体死亡。该病自1984年在日本[2]首次发现以来，现已在四大洲数十个国家中出现并造成危害[5-11]。在我国，猕猴桃溃疡病最早发生于湖南东山峰农场[8]和安徽岳西县主簿镇[12]等并造成毁园，随着‘红阳’等溃疡病敏感品种的推广和苗木调运，目前在我国16个省份的猕猴桃种植区均已发生有溃疡病危害[13-15]。中国、新西兰、美国和欧洲植物保护组织(EPPO)已分别将猕猴桃溃疡病菌作为植物检疫对象和A2类检疫性有害生物，以控制该病害的迅速蔓延。

近年来的研究发现，世界猕猴桃溃疡病菌存在5种不同的致病基因型，即Psa-J[16-17](含有编码菜豆毒素基因簇)，Psa-K[18](含有编码冠菌素基因簇)，Psa-V[19](缺乏编码菜豆毒素和冠菌素基因簇)，Psa-LV[20-21](缺少部分effector基因簇，现已定名为P.syringaepv.actinidifoliorumpv. nov)和biovar 5[22]，不同基因型菌株存在着明显的致病差异。前期国内外学者针对病菌的流行病学进行了大量研究，结果表明：溃疡病菌主要借助风雨，通过伤口以及自然的皮孔和气孔等途径来实现侵染，病害还与气象因素中温度、湿度和光照关系密切，低温冻害可以促进病害发生和流行[20]。最近有研究结果显示花粉也是溃疡病传播的主要途径，同时我们发现叶蝉可以作为中间媒介、狗尾巴草可以作为病菌的中间寄主来实现病菌的传播和侵染[23-25]。然而，针对猕猴桃溃疡病菌在自然环境下田间植株不同部位分布及其侵染后传播规律，以及土壤等潜在初侵染源的研究较少。鉴于此，本研究主要针对田间猕猴桃溃疡病菌可能在植株不同区域分布，研究可能的初侵染源和潜伏部位，初侵染途径和传播规律，为生产实际中猕猴桃溃疡病的防治提供一些借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

2012—2017年，对两处(安徽省安庆市岳西县主簿镇和安徽省六安市金寨县)典型猕猴桃溃疡病发生地区进行监测和取样，每年3、4、10、11月对每个园区按照5点取样法取样，每个点选取大小、长势基本一致的3棵植株。对每棵植株可能的溃疡病菌的田间分布地点进行取样分析，取样点分别为：1)地上(主蔓、主枝、侧枝、新稍、叶片)；2)地下(根际土壤、表土、根系)等部位分别进行3次重复取样，4℃保存。扫描电镜所需的叶片表面用75%酒精消毒后用无菌手术刀取0.5 cm × 0.5 cm的区域，将样品抽真空后放进盛有5%戊二醛固定液的无菌的离心管中，4℃保存。

1.2 方法

1.2.1 地上部位菌株的分离

主蔓、主枝、侧枝、新稍部位和叶片的处理方法：切取0.5 cm × 0.5 cm的正方形疑似病害组织于次氯酸钠中消毒30 s后无菌水清洗切碎。采用平板划线法接种于选择性培养基(SS)上，25℃培养箱中培养[1, 14]，每个部位3次重复。本试验采用标准猕猴桃溃疡病致病基因型Psa-V菌株7285、以及本实验室早期在岳西县主簿镇主栽品种‘金丰’中分离出的JF8作为对照组试验；从4℃冰箱中分别取出已保存的菌株，平板划线法接种于SS培养基上，处于相同的试验条件下进行培养。

1.2.2 地下部位菌株的分离

根系潜在病原菌分离方法同1.2.1地上部位Psa菌株的分离操作。

根际土壤、表土的处理方法：0.5 g土壤样品充分溶解于500 μL无菌水中，平板划线法接种于SS培养基上，25℃培养箱中培养[1]。每个部位3次重复。另采用Biomiga公司Soil gDNA Kit 试剂盒所提供的方法，直接提取土壤中微生物DNA。

1.2.3 菌株的纯化

于1.2.1与1.2.2中培养2 d的菌板中挑选与对照组标准菌株7285和JF8形态学类似的菌株单菌落进行标记。采用平板划线法将疑似菌株接种于金氏B培养基(KB)上，25℃培养箱中培养。2 d后于KB培养基上富集疑似菌株。再次培养2 d后挑取足量的菌体，于100 μL无菌水中涡旋均匀后裂解10 min取出，离心取上清于-20℃的冰箱中保存备用。

1.2.4 病原菌的分子鉴定

试验参考文献[26]的方法，合成目的片段492 bp的特异引物ACT1(5′→3′)：CACGATACATGGCTTATGC和ACT2(5′→3′)：GTTTCTCCACCACACTCCG。同时参考Rees-George等[27]的介绍，设计目的片段280 bp的特异引物PsaF1(5′→3′)：TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT和PsaR2(5′→3′)：CACGCACCCTTCAATCAGGATG。

反应体系总体积25 μL：1)无菌水9.5 μL，Master mix 12.5 μL，DNA 1.0 μL， 引物ACT1、 ACT2 各1.0 μL。PCR扩增反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，34个循环；72℃再延伸5 min[1]。2)其中无菌水9.5 μL，Master mix 12.5 μL， DNA 1.0 μL，引物PsaF1、PsaR2 各1.0 μL。PCR扩增反应程序为：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃再延伸5 min[1]。分别对其PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测。

1.2.5 扫描电子显微镜制样

使用0.1 mol/L PBS缓冲液(pH 7.2)3次清洗戊二醛中固定的叶片样品；分别使用30%、50%、70%、90%及100%乙醇对样品进行梯度脱水，各15 min；脱水后将样品置换至丙酮中进行CO2临界点干燥，干燥操作参考南京覃思科技有限公司K850临界点干燥仪操作规程。干燥后将样品通过碳导电胶带固定于样品台上进行镀膜上镜观察。试验的处理和操作参考实验室前期方法[28]，该试验于华中农业大学实验室公共平台进行。

2 结果与分析

2.1 猕猴桃溃疡病发病规律

安徽省安庆市岳西县主簿镇，猕猴桃种植发展于20世纪80年代，主栽品种为‘金丰’‘金魁’等中华猕猴桃品种，自首次发现溃疡病以来已30年左右；安徽省六安市金寨县，2012年开始发展猕猴桃，品种主要是‘红阳’‘东红’等中华猕猴桃品种，2013年少数果苗开始出现感病症状，次年扩散至枝条，部分园区第三年开始发病。猕猴桃溃疡病发病初期主要症状为叶片有褐色斑点，外围有黄色晕圈，后病斑扩大颜色加深，严重者可扩散至枝条，表现为皮层和髓部变褐，流出初期为白色，后变为铁锈色黏液，但根系一般不表现出感染症状(图1)。鉴于上述两个地区具有中国猕猴桃溃疡病发生和发展的典型特征(老园区和新建园区)，我们自2012—2017年来对上述两个地区进行持续监测，拟分析猕猴桃溃疡病田间全年发病规律。研究结果显示，溃疡病在安徽上述两地区表现为春季和秋季两次发病高峰，分别为3—4月份和10—11月份，春季发病率高于秋季，对于幼苗期猕猴桃，叶片发病率高于枝条。当上述两个地区的最高温度达25℃以上时，溃疡病病菌的活动明显减弱，成潜伏状态。上述规律提示叶片是溃疡病主要的初侵染部位，而找寻病菌的潜伏部位将成为溃疡病控制的关键。

A: 田间感病植株；B: 叶片出现黄色晕圈现象；C: 新稍感病初期；D: 叶片萎蔫现象；E: 侧枝组织变色；F: 主枝组织变色；G: 主蔓组织变色；H: 主蔓感病后期红色分泌物；I: 植株底部组织变色。红色箭头表示部分发病区域

图1猕猴桃溃疡病田间典型病症

Figure 1 The typical symptoms of bacterial canker of kiwifruit in the orchard

2.2 溃疡病形态学鉴定

为了分析溃疡病病菌的潜伏部位，通过SS培养基培养后使用透视显微镜进行形态学初步筛选，从而确定疑似Psa菌株。该菌株再次通过KB培养基上纯化后，对其菌落进行形态学观察筛选，并且与对照组7285和JF8菌株外观形态进行观察比较(图2)。通过该方法，我们从2013年4月的金寨地区‘红阳’猕猴桃叶片样品中成功确定并分离到溃疡病菌30株。同时，叶片和枝条的Psa分离鉴定结果显示，与溃疡病在春季和秋季两次发病高峰一致，Psa在安徽金寨和岳西两地区也表现为春季和秋季两次增殖高峰，而冬、夏季节Psa分布较少(图3)。从溃疡病形态学角度初步确定溃疡病病菌在田间植株各部位的分布，可节约鉴定时间，并为后续的PCR特异性引物检测奠定基础。

2.3 PCR检测结果分析

基于Koh等[26]和Rees-George等[27]开发的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种特异性鉴定引物，通过凝胶成像系统的结果显示：若产物在ACT1/ACT2引物扩增下492 bp处有条带，Psa F1/Psa R2引物扩增下280 bp处有条带，则初步判断为Psa菌株，为阳性；结合2.2溃疡病形态学鉴定结果，若在特定区域无条带出现则表明在本次检测中未发现溃疡病菌株，为阴性。结果显示，猕猴桃溃疡病菌在田间主要分布于地上部分的叶片、新稍、侧枝、主枝和主蔓中，表土和根系分布较低，只在岳西根际土壤中分离出溃疡病菌(表1)。

表1 Psa特异性引物ACT1/ACT2和PsaF1/PsaR2检测结果

CK：空白对照；J-：金寨；Y-：岳西；-1、-2、-3：为3次重复试验；ZM：主蔓；ZZ：主枝；CZ：侧枝；XS：新稍；YP：叶片；GJTR：根际土壤；BT：表土；GX：根系；JF-8：标准猕猴桃溃疡病菌株；“+”：有条带；“-”：无条带

A：溃疡病致病基因型Psa-V菌株7285(2 mm)；B：JF8(Psa-V) (2 mm)；C：田间纯化溃疡病菌落(2 mm)

图2猕猴桃溃疡病菌菌落(KB)形态

Figure 2Pseudomonassyringaepv.actinidiaecolonies (KB) morphology

图3 不同时间猕猴桃叶片和枝条的Psa分布

2.4 溃疡病病部组织结构扫描电子显微镜观察

在自然状态下，植株的叶片往往会受到外界不同程度的伤害。我们的前期结果提示叶片是溃疡病主要的初侵染部位，而且，文献报道，风雨和伤口是溃疡病传播的主要影响因素和途径。因此本研究主要针对田间植株叶片组织结构进行扫描电子显微镜观察(图4)。结果显示，与正常叶片组织比较(图4-A)，猕猴桃植株叶片在感病过程中，菌株在叶片呈不均匀分布，感病叶片的伤口处的菌株含量远大于感病叶片的完好区域(图4-B、C、D)，说明当叶片被菌株侵染后，尤其在伤口处菌株能大量繁殖，导致叶片会出现相应的病斑。因此，在自然状态下，减少对植株部位的伤害可以

A：正常植株叶片(10 μm，×1000)；B：植株感病叶片(10 μm，×1000)；C：感病叶片伤口处(10 μm，×1000)D: 叶片伤口处(10 μm，×2000)

图4溃疡病病部叶片组织结构扫描电子显微镜观察

Figure 4 Observation of leaf tissue structure ofPseudomonassyringaepv.actinidiaeby scanning electron microscopy

有效地降低病菌的侵染率。

3 讨论与结论

当今猕猴桃溃疡病已经严重影响到我国乃至全球猕猴桃产业的有效发展。目前，猕猴桃溃疡病主要发生并危害中华和美味猕猴桃的花蕾、叶片、主蔓和枝蔓，软枣猕猴桃中溃疡病只在叶片中表现出症状，对于植物生长没有明显影响[23]。新西兰学者发现中华和美味猕猴桃的雄花花粉可以有效传播猕猴桃溃疡病[24]，猕猴桃果实和根部未明显呈现溃疡病症状，因此园区的溃疡病感染不会对果实的销售造成影响，但是溃疡病对猕猴桃的品质和贮藏性能影响较大[23]。最近，我们研究发现在溃疡病发病园区中的狗尾巴草、空心莲子草和泡桐中具有类似溃疡症状，通过分离可以获得猕猴桃溃疡病菌株，证实上述3种植物具有中间寄主的能力[23]。然而，针对猕猴桃溃疡病菌在自然环境下田间植株不同部位分布及其侵染后传播规律，以及土壤等潜在初侵染源的研究较少，而明确猕猴桃溃疡病菌在田间感病植株上的分布及其侵染后的传播规律对其防治具有重要意义。

本试验基于Koh等[26]和Rees-George等[27]开发的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种特异性鉴定引物，利用分离的方法以及标准猕猴桃溃疡病致病基因型Psa-V菌株7285和本实验室中基因组测序的溃疡病菌株JF8为对照，形态学筛选后，以菌株DNA和土壤DNA为模板，使用PCR分子检测方法对于潜在的初/再侵染源进行鉴定。结果显示溃疡病菌株主要寄生于发病植株的主蔓、主枝、侧枝、新稍和叶片，而根际土壤、表土和根系等可以直接或间接接触溃疡病菌株的园区场所，极少发现有溃疡病的存在，说明猕猴桃溃疡病菌株一方面离开猕猴桃组织后生存能力就会受到影响，这与黄其玲等[29]研究发现根系GFPuv标记猕猴桃溃疡病菌灌根处理后溃疡病菌株的数量会逐渐减少，在没有灭菌的土壤中，猕猴桃溃疡病菌冬季和夏季在土壤中的存活时间不超过30 d的结果一致。

同时，本研究发现猕猴桃植株叶片在感病过程中，菌株在叶片呈不均匀分布，感病叶片的伤口处的菌株含量远大于感病叶片的完好区域。由此可见，活体或猕猴桃衰亡组织才是猕猴桃溃疡病菌的主要寄生场所，同时狗尾巴草、空心莲子草和泡桐等园区其他植物作为中间寄主和初/再侵染来源可能在猕猴桃溃疡病菌的传播和蔓延过程中起到了不可替代的作用[23]。感病中华和美味猕猴桃的雄株花粉则是感病园区猕猴桃溃疡病快速扩散的主要潜在途径[30]。不同时间点Psa分离鉴定结果显示溃疡病在安徽金寨和岳西两地区表现为春季和秋季两次发病高峰，冬夏分布较少，溃疡病菌初期仅感染叶片，随病情加重，病菌扩散至其他组织。上述研究结果显示对于初发生猕猴桃溃疡病的园区，及时铲除病组织或从地上部位铲除枝组以及减少植株伤口，可以有效控制猕猴桃溃疡病的进一步发生和蔓延。

本研究一定程度上解释了为什么猕猴桃溃疡病的感病园区难以完全控制的原因。但是现有资料还没能完全解释溃疡病的主要越冬场所和初/再侵染来源，鉴于此，本研究对发病园区可能的初侵染源猕猴桃溃疡病感病植株的不同部位进行了鉴定(由于花粉和部分园区杂草被鉴定是可以传播溃疡病的中间介质，是溃疡病发生的传染源，果实一般成熟后通过收获方式离开园区，不会成为传染源，本文未涉及)，通过对猕猴桃溃疡病园区感病植株的不同部位(包括根际和土壤)进行检测可以揭示猕猴桃溃疡病主要侵染和寄生的部位，而猕猴桃溃疡病的主要分布部位一般是初/再侵染源，上述研究分析为猕猴桃溃疡病的防治奠定了基础。