消癌平对伊马替尼在大鼠体内外代谢的影响

黄曦 章利亚 郑宇红 夏迎春 黄笑夏

通关藤茎中含有以通关藤苷元甲、通关藤苷元乙、通关藤苷元丙、通关藤素为代表的4类C21甾体苷，具有抗肿瘤活性[1]。消癌平注射液是从通关藤的干燥藤茎中提炼且精制而成的中药抗肿瘤注射剂，为单方制剂，自上市以来，广泛用于各种恶性肿瘤的治疗，如肺癌、肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、胃癌、多发性骨髓瘤、急性髓细胞白血病等[2-8]。目前，临床上中药注射剂与其他药物联合使用的现象非常普遍。然而，市面上许多中药注射剂说明书对药物相互作用的描述过于简单、模糊，甚至缺乏[9]。细胞色素P450酶系是多数药物的主要代谢酶，由此引发的潜在药物相互作用已得到广泛重视。甲磺酸伊马替尼是治疗慢性期、急变期或加速期慢性髓性白血病和复发或转移性胃肠间质瘤的一线用药，在体内主要经肝微粒体细胞色素P450中的CYP3A4代谢，而CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6和CYP2C19等代谢酶对伊马替尼的代谢影响较小[10]。相关文献报道，消癌平注射液能够抑制CYP3A4的活性，但未见其对伊马替尼代谢影响的相关报道。本研究先建立同时检测大鼠血浆中伊马替尼及N-去甲基伊马替尼浓度的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS），再观察消癌平注射液在体内外对伊马替尼药代动力学的影响，为其药物相互作用的研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 雄性健康SD大鼠16只，体质量（250±50）g，由温州医科大学动物实验中心提供，实验动物许可证号：SYXK（浙）2015-0009。

1.2 主要试剂 甲磺酸伊马替尼（规格100mg，批号S102606，美国Selleck Chemicals LLC公司）；N-去甲基伊马替尼对照品（规格10mg，批号241902，美国Sigma公司）；卡马西平对照品（规格50mg，批号0142-9503，中国药品生物制品检定所）；消癌平注射液（规格20ml，批号201511061，中国南京圣和药业有限公司）；人和大鼠肝微粒体（本实验室自制）；还原性辅酶Ⅱ（NADPH，规格1g，批号N041939-1G，瑞士罗氏公司）。

1.3 主要仪器 ACQUITY H-Class超高效液相色谱仪、Masslynx 4.1色谱工作站和XEVO TQD三重四级杆质谱仪（美国 Waters公司）；TGL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；Milli-Q纯水机（美国Millipore公司）；QL-866涡旋混合器（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；FA2004电子分析天平（上海方瑞仪器有限公司）；DKZ-450B电热恒温振荡水槽（上海森信实验仪器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18 Column（2.1×50mm，1.7μm，particle size，Waters Corp）；流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱：0～0.5min，40%→85%乙腈，0.5～1.3min，85%乙腈，1.3～1.5min，85%→40%乙腈，1.5～2.5min，40%乙腈；流速：0.4ml/min，柱温40℃

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子化源，正离子检测模式。定量分析的离子反应分别为伊马替尼m/z 494.3/394.2，N-去甲基伊马替尼m/z 480.2/394.2，内标卡马西平m/z 237.1/194.2。毛细管电压2kV；伊马替尼、N-去甲基伊马替尼、卡马西平的锥孔电压分别为55、40、40V，碰撞电压分别为30、30、20V；离子源温度150℃；去溶剂化温度500℃；本仪器用氮气作去溶剂化气体（800L/h）及锥孔气体（50L/h）。

1.4.3 体外试验 （1）肝微粒体孵育体系：分别将2μl消癌平注射液和2μl消癌平注射液10倍稀释液（对照组不加消癌平注射液），加入含0.024 7mg/ml伊马替尼溶液和相应浓度的微粒体孵育体系（0.5mg/ml鼠肝微粒体和0.632 5mg/ml人肝微粒体），200μl孵育体系见表1，每个浓度平行2管。将孵育体系置于37°C水浴恒温振荡器中预孵育5min，加入1mM的NADPH启动反应。孵育30min后立即冷却到-80°C终止反应。（2）血浆样品处理：反应终止后，加入400μl乙腈溶剂沉淀蛋白，再加入内标1μg/ml卡马西平甲醇溶液20μl，涡旋混匀2min，13 000r/min 离心 10min，取 100μl上清液与 100μl超纯水1∶1稀释混匀，2μl稀释液进样检测。

表1 肝微粒体孵育体系

1.4.4 体内试验 （1）给药方法与样品采集：将16只SD大鼠随机分为两组，即对照组和给药组，每组8只。其中给药组大鼠按7.5ml/kg腹腔注射消癌平注射液，1次/d，连续10 d。给药组最后一次给予消癌平注射液后，两组大鼠单次灌胃伊马替尼（30mg/kg），分别于灌胃后的 0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24h 取 大 鼠 尾 静 脉 血 样0.5ml于1.5ml EP管中，13 000r/min离心10min，分离的血浆于-80℃冰箱保存待测。（2）血浆样品处理：样品解冻后，取100μl于EP管中，加入乙腈溶剂200μl来沉淀蛋白，再加入1μg/ml卡马西平甲醇溶液20μl，并涡旋混匀2min，充分混匀后13 000r/min离心10min，取上清液100μl与超纯水100μl（1∶1）稀释混匀，2μl稀释液进样检测。

1.5 方法学考察 在正式实验前，参照体内试验的血浆样品处理方法进行处理，并作质谱分析，记录伊马替尼、N-去甲基伊马替尼和内标峰面积，以伊马替尼、N-去甲基伊马替尼与内标的比值为纵坐标，以伊马替尼和N-去甲基伊马替尼为横坐标绘制标准曲线，得出两者的线性回归方程。伊马替尼、N-去甲基伊马替尼的浓度分别为 50、1 000、10 000 和 20、100、1 000ng/ml，取每种浓度样品6份，参照体内试验的血浆样品处理方法进行处理；同一天测定日内精密度，连续3d作同样操作，以测定日间精密度。取上述每种浓度样品6份处理后检测，依据标准曲线计算检测浓度，以检测的峰面积直接与相应浓度的伊马替尼、N-去甲基伊马替尼对照品溶液直接进样所得的峰面积进行比较，计算提取回收率。将已处理空白血浆配制的上述浓度的伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的标准品溶液峰面积与相应浓度的标准品直接进样的峰面积比较，计算基质效应。同时考察预处理样品在室温、自动进样器、-20℃放置和反复冻融条件下的稳定性。

1.6 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件，计量资料用表示，组间比较采用两独立样本t检验。应用DAS 3.0软件对药动学参数进行分析。

2 结果

2.1 UPLC-MS/MS分析结果 实验结果表明，内源性杂质峰不干扰测定，伊马替尼、N-去甲基伊马替尼与内标及血浆中的内源性物质能得到良好的分离，结果见图1。伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的线性回归方程分别为 y1=0.000 3 x1＋0.036 3（r2=0.999 2）和 y2=0.000 07 x2＋0.000 2（r2=0.999 5），血浆浓度分别在 20～10 000、1～1 000ng/ml时线性关系良好，定量下限分别为20、1ng/ml。伊马替尼的日间、日内精密度相对标准偏差（RSD）均＜15%，N-去甲基伊马替尼的日间、日内精密度RSD亦均＜15%。伊马替尼低、中、高浓度的提取回收率分别为（88.11±7.15）%、（92.61±6.00）%、（87.67±5.08）%，基质效应分别为（86.44±10.29）%、（89.15±7.74）%、（97.06±7.27）%；N-去甲基伊马替尼低、中、高浓度的提取回收率分别为（87.26±11.16）%、（97.66±5.77）%、（98.89±3.54）%，基质效应分别为（96.08±3.52）%、（101.64±3.25）%、（93.95±4.58）%。伊马替尼和N-去甲基伊马替尼分别在室温放置12h、自动进样器中放置12h、经历3次冻融（冷冻与解冻循环）、-20℃放置12d，稳定性良好。该法可用于伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的血浆测定。

2.2 消癌平在体外对伊马替尼的作用 以伊马替尼为底物，消癌平注射液和消癌平注射液10倍稀释液在大鼠肝微粒体中的抑制作用分别达到了90.83%和50.73%，在人肝微粒体中的抑制作用分别达到了79.44%和28.77%。由此得出，消癌平在大鼠肝微粒体和人肝微粒体中对伊马替尼均有明显的抑制作用。

2.3 血药浓度-时间曲线 两组大鼠按30mg/kg单剂量灌胃伊马替尼后，随着时间的增加，伊马替尼、N-去甲基伊马替尼的血药浓度曲线右移，见图2-3。

图1 伊马替尼及N-去甲基伊马替尼的UPLC-MS/MS色谱图（a：空白血浆，b：伊马替尼和N-去甲基伊马替尼血浆对照品；c：血浆样品）

图2 两组大鼠血浆伊马替尼的药-时曲线

图3 两组大鼠血浆N-去甲基伊马替尼的药-时曲线

2.4 药动学参数 伊马替尼和N-去甲基伊马替尼药动学数据经过DAS 3.0软件处理后，采用非房室模型统计矩计算药动学参数，结果见表2～3。相比于空白对照组，大鼠按7.5ml/kg连续10d腹腔注射消癌平注射液后，血浆伊马替尼达峰时间（Tmax）由2.500h延长至5.143h，延后了105.72%；表观分布容积（Vz/F）由2.682L/kg减少至2.018L/kg，减少了24.76%；AUC增加，峰浓度（Cmax）增大，清除率（CLz/F）减小。相比于空白对照组，大鼠按7.5ml/kg连续10d腹腔注射消癌平注射液后，血浆 N-去甲基伊马替尼AUC(0-t)由 13 470.171μg/L·h减少至 10 591.962μg/L·h，减少了 21.37%；AUC(0-∞)由13 915.901μg/L·h 减少至 11 231.875μg/L·h，减少了19.29%；Tmax由4.667h延长至5.067h，延后了35.70%；Cmax由1 112.462μg/L减少至889.847μg/L，减少了20.01%；Vz/F由14.723L/kg增加至21.405L/kg，增加了45.38%；CLz/F由2.241L/（h·kg）增加至2.968L/（h·kg），增加了32.44%；半衰期延长，平均停留时间延长。由此得出，消癌平注射液对伊马替尼、N-去甲基伊马替尼的药代动力学有一定的影响。

表2 两组大鼠血浆伊马替尼的药动学参数

表3 两组大鼠血浆N-去甲基伊马替尼的药动学参数

3 讨论

伊马替尼在体内主要经肝微粒体CYP3A4代谢生成N-去甲基伊马替尼，它可能与多种药物产生相互作用，如辛伐他汀、美托洛尔、利福平、环孢菌素、华法林等[10]。相关文献报道，消癌平注射液能抑制CYP3A4的活性[11]。刘丽雅等[12]利用体外人肝微粒体孵育技术，从药物代谢方面观察消癌平注射液对CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 和 CYP3A4/5 各亚酶的活性影响，结果表明除CYP2D6外，消癌平注射液对其他亚酶均有明显的抑制作用。周静雅[13]将消癌平注射液加入到体外人肝微粒体孵育体系中，探究其对 CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 和 CYP3A4 各亚酶的活性影响，实验结果显示消癌平对以上5个酶均有抑制作用，且对CYP3A4的半抑制浓度（IC50）为46 000ng/ml；同时进一步开展了消癌平注射液和化疗药物多西他赛大鼠体内药代动力学实验，结果显示消癌平注射液能够抑制CYP3A4底物多西他赛在大鼠体内的代谢过程。本研究以伊马替尼为底物，消癌平注射液为抑制剂，消癌平注射液和消癌平注射液10倍稀释液对伊马替尼的抑制作用在大鼠肝微粒体中分别达到了90.83%和50.73%，消癌平注射液和消癌平注射液10倍稀释液对伊马替尼的抑制作用在人肝微粒体中分别达到了79.44%和28.77%；这说明消癌平注射液对伊马替尼有明显的抑制作用。

虽然肝微粒体体外温孵法对反应体内代谢情况具有一定的价值，但考虑到药物在体内的代谢过程非常复杂，因此还需要体内实验作进一步研究。基于体外实验结果，笔者又进行了消癌平注射液与伊马替尼在大鼠体内的药代动力学实验。在实验中，笔者建立了UPLCMS/MS，可同时检测大鼠血浆中伊马替尼及其活性代谢产物N-去甲基伊马替尼浓度。相比于高效液相色谱，UPLC-MS/MS具有耗时短、进样量少、灵敏度高等优点，是一种检测伊马替尼及其活性代谢产物N-去甲基伊马替尼浓度的有效手段。从动物体内实验结果可知，大鼠腹腔注射消癌平后，血浆伊马替尼及其活性代谢产物N-去甲基伊马替尼的药代动力学参数发生了改变：相比于空白对照组，大鼠按7.5ml/kg连续10d腹腔注射消癌平注射液后，血浆伊马替尼的Tmax延后了105.72%，Vz/F减少了24.76%；血浆N-去甲基伊马替尼的AUC(0-t)减少了 21.37%，AUC(0-∞)减少了 19.29%，Tmax延后了 35.70%，Cmax减少了20.01%，Vz/F增加了45.38%，CLz/F增加了32.44%。由此得出，消癌平注射液对伊马替尼、N-去甲基伊马替尼的药动学有一定的影响。

笔者发现，体外实验中消癌平注射液对伊马替尼代谢表现出明显的抑制作用；但在大鼠体内实验中消癌平注射液对伊马替尼代谢未表现出明显的抑制作用，考虑与体内生理环境复杂且影响因素（吸收、分布、排泄等）较多有关。相关研究结果显示，血浆伊马替尼浓度与慢性粒细胞白血病[14]、胃肠间质瘤[15]的疗效息息相关，而个体间伊马替尼的CLz/F又有40%的差异[16]，药物相互作用对伊马替尼血药浓度的影响在个体间可能被放大，进而导致治疗失败和不良反应发生。由于消癌平注射液和伊马替尼均为肿瘤科常用药物，此实验结果具有潜在的临床意义。本实验为消癌平注射液与伊马替尼合用的初步结果，且伊马替尼为单次给药。由于甲磺酸伊马替尼临床常用剂量为400～600mg/d，最大剂量可加至800mg/d，且需要长期给药，长期联合用药的结果可能会产生更大的影响。

总之，本研究在人与大鼠肝微粒体体外孵育药物的体系中，以伊马替尼为底物，加入消癌平注射液，结果显示其在相应微粒体孵育体系中对伊马替尼的代谢过程有明显的抑制作用。结合消癌平注射液对伊马替尼在大鼠体内的药代动力学的影响，在临床同时应用消癌平注射液和伊马替尼时，应密切关注患者的临床症状及伊马替尼血药浓度Tmax。