慢性髓细胞白血病患者Th1及CD8+T淋巴细胞水平与疗效的相关性分析*

代景莹，邹孟颖，杨 曦，魏 卿，王 宇，李 慧，黄晓兵，王晓冬△

(1.电子科技大学附属四川省人民医院血液科，成都 611731；2.四川省医学科学院·四川省人民医院血液科，成都 610072；3.中国科学院四川转化医学研究医院，成都 610072)

慢性髓细胞白血病(CML)以出现Ph染色体而形成BCR-ABL融合基因为特征[1]，在酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)时代，CML的疗效得到了革命性的改善[2]，而更新的TKI还表现出除抗肿瘤作用之外的显著免疫调节功效，如第二代TKI达沙替尼[3-4]。有部分CML患者当前可进入无治疗观察阶段[5]。但目前仍有部分患者不可避免地发生疾病进展[6]，且目前对于首选TKI、换药指征、停药决策等问题尚无明确统一定论，笔者认为可从免疫状态评估的角度对CML患者的上述问题进行指导，通过免疫指标的特点与临床疗效之间的相关性研究，可评估患者为处于优势或劣势免疫状态，从而协助指导是否应更早更换为兼具抗BCR-ABL及免疫调节功效的药物以更好地改善疗效，亦可协助患者的疗效预测、预后评估，甚至在患者的停药策略等问题上起到一定指导意义。而目前认为抗肿瘤免疫主要由细胞免疫应答模式介导，其中辅助性T淋巴细胞1(Th1)及效应性T淋巴细胞CD8+T淋巴细胞发挥着最为重要的作用[7-9]。由此，笔者对CML患者的Th1及CD8+T水平进行了检测，并将其与临床疗效的相关性进行分析。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究纳入2018年2-12月于四川省人民医院血液科就诊，并确诊为CML的患者。纳入的所有患者均通过骨髓细胞形态学、细胞遗传学及分子生物学检查确诊，符合国内统一的诊断与分期标准。本研究检测、分析了纳入患者的外周血Th1及CD8+T淋巴细胞水平，并均按照患者进行采血检测当日的状态，对患者进行临床缓解状态的评估。其中，初诊组、细胞遗传学完全缓解(CCyR)组及分子学缓解4.5(MR4.5)组患者的比较中：初诊组10例，男7例，女3例，中位年龄32.5岁(19.0～74.0岁)；CCyR组13例，男10例，女3例，中位年龄64.0岁(25.0～70.0岁)；MR4.5组67例，男39例，女28例，中位年龄46.0岁(17.0～78.0岁)。Th1高CD8+T高组与Th1高CD8+T非高组、Th1低CD8+T高组患者的比较中(Th1高与CD8+T高指Th1比例值与CD8+T比例值高于正常范围上限，CD8+T非高指CD8+T比例值为正常范围内或低于正常范围下限，Th1低指Th1比例值低于正常下限)：Th1高CD8+T高组15例，男8例，女7例，中位年龄49.0岁(17.0～78.0岁)；Th1高CD8+T非高组17例，男10例，女7例，中位年龄48岁(17.0～84.0岁)；Th1低CD8+T高组10例，男8例，女2例，中位年龄34岁(26.0～61.0岁)。本研究为回顾性研究，符合与人相关研究伦理学标准并得到医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1T淋巴细胞亚群的检测 采集患者外周血并通过流式细胞学技术检测其T淋巴细胞亚群CD8+T淋巴细胞比例(CD8+T/Lymphocyte)与Th1细胞比例(Th1/CD4+T)。CD8+T淋巴细胞比例引用四川省人民医院流式细胞检测报告中的正常参考范围(17.6%～30.4%)，Th1细胞比例(Th1/CD4+T)引用海斯特检验机构的正常参考范围(11.8%～25.8%)。采用BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪进行检测，所需的免疫荧光抗体均购自美国BD公司。(1)Th1细胞比例的检测：全血+RPMI1640培养基混匀，然后加入刺激剂[包括布雷非德菌素A、佛波醇酯(PMA)、离子霉素]在培养箱中培养孵育4 h，取出并加入相应荧光素标记的抗体(抗CD3抗体、抗CD8抗体)，混匀之后于室温孵育20 min。再加入10×红细胞裂解液(BD FACS Lysing Solution)，震荡，室温10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗后，加入相应的固定剂，孵育30 min，PBS洗2遍，其后加入干扰素-γ(IFN-γ)抗体，孵育20 min，其后PBS洗1遍，加入适量PBS重悬待上机检测。Th1细胞的表面标志为CD3+CD4+，而当用PMA刺激4 h时，会发现CD4+细胞明显减少，甚至消失，这是因为PMA会诱发细胞表面CD4分子被内吞。所以本研究用CD3和CD8反设CD4细胞，即CD3+CD8-细胞被认为是CD3+CD4+细胞。(2)CD8+T/Lymphocyte的检测：红细胞裂解液裂红处理15～20 min，离心，加入相应荧光素标记的抗CD45抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体避光4 ℃孵育20 min，PBS洗后离心，重悬于适量PBS中待上机检测。数据分析采用Diva流式数据分析软件进行。

1.2.2疗效评估 治疗反应定义与疗效评估标准参照中国慢性髓性白血病诊断与治疗指南(2016年版)[10]：CCyR定义为Ph+细胞为0；主要分子学缓解(MMR)定义为BCR-ABLIS≤0.1%；MR4.5定义为BCR-ABLIS≤0.003 2%。基于本研究患者例数较少，并考虑到分析、比较仍具有价值及指导意义，本研究中未缓解指未达到CCyR的患者，包括血液学缓解但未达到CCyR的患者及未达到血液学缓解的患者。

2 结 果

2.1初诊组、CCyR组及MR4.5组患者Th1/CD4+T分析 本研究分析了CML患者初诊未治疗时(n=10)、治疗后获得CCyR时(n=13)及治疗后获得MR4.5时(n=67)的Th1水平(Th1/CD4+T)，发现70.00%的初诊组患者Th1/CD4+T低于正常范围下限(Th1/CD4+T引用海斯特检验机构的正常参考范围11.8%～25.8%),CCyR组、MR4.5组分别只有15.38%、15.15%的患者Th1/CD4+T低于正常下限。初诊组的Th1降低率高于CCyR组及MR4.5组，差异均有统计学意义(P=0.01、0.00)，见图1。另一方面，初诊组患者Th1/CD4+T值(9.98±7.68)%低于CCyR组(21.27±10.77)%及MR4.5组(21.16±10.17)%，差异均有统计学意义(P=0.01、0.00)，见图2。

图1 初诊组、CCyR组及MR4.5组Th1/CD4+T低于正常范围下限的患者百分比比较

2.2Th1高CD8+T高组与Th1高CD8+T非高组临床缓解状态比较 Th1水平可促进CD8+T淋巴细胞的活化与增殖、进一步发挥细胞免疫应答的效应，而由于在临床中观察发现Th1及CD8+T水平均高于正常上限的患者具有更优的缓解状态，本研究进一步比较Th1高CD8+T高组患者(n=15)与Th1高CD8+T非高组患者(n=16)临床缓解状态(CD8+T/Lymphocyte值参考医院流式细胞检测报告中正常参考范围17.6%～30.4%)，结果显示86.67%的Th1高CD8+T高组患者及52.94%的Th1高CD8+T非高组患者达到MR4.5，两组MR4.5率比较，差异有统计学意义(P=0.03)；而13.33%的Th1高CD8+T高组患者及17.65%的Th1高CD8+T非高组患者为未缓解，两组的未缓解率比较，差异无统计学意义(P=0.74)，见图3。

图2 初诊组、CCyR组及MR4.5组患者Th1/CD4+T比较

A：Th1高CD8+T高组；B：Th1高CD8+T非高组

图3 Th1高CD8+T高组与Th1高CD8+T非高组临床缓解状态比较

A：Th1高CD8+T高组；B：Th1低CD8+T高组

图4 Th1高CD8+T高组与Th1低CD8+T高组临床缓解状态比较

2.3Th1高CD8+T高组与Th1低CD8+T高组临床缓解状态比较 临床中观察发现Th1/CD4+T值低于正常下限，且CD8+T比例值高于正常上限的患者更多地表现出不良的临床疗效与缓解状态，由此本研究进一步比较Th1高CD8+T高组患者(n=15)与Th1低CD8+T高组患者(n=10)临床缓解状态，结果显示：86.67%的Th1高CD8+T高组患者及20.00%的Th1低CD8+T高组患者达到MR4.5，两组MR4.5率比较，差异有统计学意义(P=0.00)；而13.33%的Th1高CD8+T高组患者及80.00%的Th1低CD8+T高组患者为未缓解，两组未缓解率比较，差异有统计学意义(P=0.00)，见图4。

3 讨 论

随着对肿瘤免疫的认识不断深入，对肿瘤患者的免疫状态评估及免疫分层在临床治疗方案选择、疗效评价、预后评估等方面有着重要指导意义[11-12]，而以提高患者自身抗肿瘤免疫力为目标的各种免疫治疗策略亦得到了快速及有效的发展[13-15]。目前认为体内抗肿瘤主要由细胞免疫应答模式介导，而其中Th1为主导体内向细胞免疫应答模式转化的重要辅助性T淋巴细胞亚群，它分泌IFN-γ、白细胞介素-2(IL-2)等Ⅰ型免疫应答细胞因子而提供给CD8+T淋巴细胞彻底活化的第3信号，从而促进CD8+T淋巴细胞的活化与增殖，CD8+T淋巴细胞作为细胞免疫应答中的效应性T淋巴细胞进一步执行最终识别及有效清除癌细胞的任务[7-9]。笔者前期研究亦发现，Th1水平的升高与临床疗效呈正相关[16]。由此，Th1及CD8+T淋巴细胞为抗肿瘤细胞免疫应答中起着最为关键作用的两个T淋巴细胞亚群。基于此，笔者认为对CD8+T淋巴细胞及Th1水平的监测对于肿瘤患者的抗肿瘤免疫力评估、疗效预测及预后评估等可能具有一定的指导意义，且Th1及CD8+T淋巴细胞水平的检测通过流式细胞术实现具有检测方法较简单、成本低、作为临床长期免疫监测指标可行性强等优点。由此，笔者所在课题组对长期诊疗、随访的CML患者进行了Th1水平(Th1/CD4+T)及CD8+T水平(CD8+T/Lymphocyte)的检测与分析。

研究结果显示，Th1高CD8+T高的患者表现出较Th1高CD8+T非高的患者更高的MR4.5率(P=0.03)，提示Th1及CD8+T双高的患者具有更深的缓解度。另一方面，本研究将Th1高CD8+T高的患者与Th1低CD8+T高的患者进行比较，发现前者的MR4.5率明显高于后者(P=0.00)，而前者的未缓解率却明显低于后者(P=0.00)，提示Th1高CD8+T高的患者具有更高的缓解率与更深的缓解度。本研究上述结果均提示，Th1高CD8+T高的患者有更大的概率获得更好的疗效及更优的预后。

除此之外，本研究还对初诊未治疗时CML患者的Th1水平进行了分析，并与治疗后达到CCyR或MR4.5的患者进行比较，发现治疗后获得CCyR或MR4.5的患者Th1/CD4+T值均较初诊患者高(P=0.01、0.00)；另一方面，初诊未治疗患者Th1/CD4+T值低于正常下限的患者比例增多，70.00%的初诊组患者Th1/CD4+T值低于正常下限，而仅有15.38%的CCyR组患者及15.15%的MR4.5组患者其Th1/CD4+T值低于正常下限，提示初诊未治疗患者的Th1水平显著低下。笔者推论治疗后患者若发生良好的治疗反应并逐渐获得更深的缓解深度，其自身机体免疫力将得到相应的恢复与提升，从而具备更强的自身抗肿瘤免疫力，利于进一步有效清除体内残存的肿瘤细胞，这一假设推论与本研究观察得到的结果一致，即在治疗后获得良好的缓解情况伴随着Th1水平的显著提升。由此，Th1水平的监测对于患者的疗效预测与预后评估可起到一定指导意义。

值得注意的是，笔者所在课题组前期研究亦已分析了不同TKI治疗后患者的免疫指标特点，结果显示达沙替尼组患者的Th1水平明显高于尼洛替尼组及伊马替尼组，显示出达沙替尼特有的免疫调节作用[16]。但笔者所在课题组进一步分析，达沙替尼组、尼洛替尼组及伊马替尼组中各自分别均有缓解良好及缓解不理想的患者，而3组中缓解不理想的患者均常常伴随着不理想的免疫指标状况，由此，本文旨在单从免疫学的角度进行分析(而并不考虑患者使用何种TKI治疗的因素)，以探索免疫指标Th1及CD8+T淋巴细胞与疗效的相关性，以期在CML临床诊疗中起到一定的指导意义，并在本研究中证实了免疫指标Th1及CD8+T淋巴细胞对疗效预测具有一定指导意义。

综上所述，初诊未治疗CML患者表现出低下的Th1水平，而治疗后Th1水平的提升预示更好的治疗反应；治疗后Th1及CD8+T双高提示更高的临床缓解率及更深的缓解度，而Th1低CD8+T高提示不理想的临床状态。因此，Th1水平及CD8+T淋巴细胞水平可作为临床对CML患者的长期规律免疫监测指标，以助于评估患者免疫状态，并对CML患者的临床疗效预测起到一定的指导作用。