人微小纤溶酶原cDNA在毕赤酵母中的高效表达及活性检测

王 娜，何成霞，邹 强，苟兴华，陈 松，吴昊俣，蔡心析，许天恒

(成都大学，四川 成都 610106)

【研究意义】人纤溶酶原由791个氨基酸被分子内24个二硫键折叠形成多结构域的糖蛋白，其分子量约92～94 kDa。人纤溶酶原包含3个结构域：N端肽链、五环结构域和丝氨酸活性中心[1]。人纤溶酶原是丝氨酸类酶人纤溶酶的前体，主要在肝脏中合成，进而分泌到血液和细胞外液中[2]。人纤溶酶原的激活是纤溶级联的中心事件，纤溶酶原被激活剂高效切割R561～V562的肽键激活形成纤溶酶，该物质可以分解体内的血块[3]。纤溶酶还在金属蛋白酶激活、伤口的愈合、器官移植、血管再生术、病原体和肿瘤细胞的侵袭等反应中发挥重要的作用[4-8]。人纤溶酶原是一条氨基酸链组成而人纤溶酶是由两条链组成；重链包含N端肽链、五环结构域，轻链包含丝氨酸活性中心[9]。人微小纤溶酶原不仅分子量小、扩散快、易于大批制备、可长期贮存，并可避免交叉污染，对于眼科疾病及其并发症的治疗有很好的效果。【前人研究进展】尿激酶和葡激酶都可以作为纤溶酶原激活剂，这些激活剂本身就可以作为治疗溶栓障碍的药物[10]。而纤溶酶治疗血栓疾病的效果最好。近期发现纤溶酶原在治疗人玻璃体后脱落有很大的效果。由于栓塞局部血流阻断，纤溶酶原不能持续补充，所以效率不高。如果注射人微小纤溶酶原到视网膜静脉，可以使静脉血栓溶解，血管再通，而达到治疗效果。【本研究切入点】本文中通过去除人纤溶酶原的N端多肽及5个三角区，形成的人微小纤溶酶原是PlgC端549～790位间的241个氨基酸残基组成的肽链(包含丝氨酸蛋白酶结构域)，分子量约29 kDa，有6对二硫键，没有PlgN端5个三角区，但是被激活后能够形成具有纤溶活性的mplm。由于人微小纤溶酶原含有二硫键，在大肠杆菌中翻译后，不能进一步加工折叠，分离纯化后需要对人微小纤溶酶原进行复性，最高复性率为50 %，该过程繁琐且具有不定性，而在动物细胞中表达成本非常高。【拟解决的关键问题】本文选择pPICZαA作为载体，其含有α-factor可以将人微小纤溶酶原分泌至胞外，用毕赤酵母作为宿主菌可以对人微小纤溶酶原进行正常折叠。甲醇诱导人微小纤溶酶原的表达，从而实现人微小纤溶酶原在毕赤酵母中的高效表达，为眼科疾病治疗的研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株和质粒E.coliJM109、pPICZαA、PichiaSMD1168。

1.1.2 重组质粒构建及相关试剂耗材 限制性内切酶XhoI和NotI，SacI, ligation试剂盒，PCR片段纯化试剂盒均购置于Takara；氨苄青霉素和博来霉素；质粒DNA小抽试剂盒购置于QIAUGEN。其它化学试剂均为国产试剂。

1.1.3 主要仪器和设备 DNA电泳仪、PCR仪、超净工作台、离心机、恒温培养箱、温控摇床、蛋白电泳系统、脱色摇床、恒温金属浴锅和紫外分光光度计。

1.2 试验方法

1.2.1 人微小纤溶酶原基因序列的设计及扩增 从NCBI数据库中调取已知人微小纤溶酶原氨基酸序列，然后通过Sequence Quickie-Calc软件根据毕赤酵母密码偏爱性获得人微小纤溶酶原的基因序列并在两端加入NotI和XhoⅠ内切酶识别的基因序列，然后委托生物工程公司合成。

1.2.2 人微小纤溶酶原基因与pPICZαA质粒的连接 培养含有pPICZαA的E.coliJM109到对数生长期时提取质粒，用限制酶NotⅠ和XhoⅠ双酶切分别处理pPICZαA和mPlg基因后纯化，用DNA连接酶连接形成pPICZαA-mPlg后转化至E.coliJM109。筛选重组子，提取阳性转化菌的质粒，直接用BglⅡ37 ℃，1 h，酶切之后跑核酸电泳看其核酸片段大小是否符合要求。

1.2.3 重组质粒pPICZαA-mPlg的扩增及构建多拷贝 取单菌落的E.coliJM109将其接种到LB培养基中进行活化至对数生长期，用化学法提取重组质粒pPICZαA-mPlg。用BglⅡ和BamHⅠ双酶切重组质粒，获得包含AOX1启动子、α信号肽和微小纤溶酶原基因的片段，同时BamHⅠ处理含有目的基因的重组质粒，用连接酶将含有目的基因元件连接到线性化的重组质粒中，最后用BglⅡ和BamHⅠ来消除头头相连和尾尾相连的多拷贝，依次重复两次以上操作，获得4拷贝的pPICZαA-mPlg重组质粒。然后用bstXⅠ酶切重组的多拷贝质粒，苯酚-氯仿溶液沉淀蛋白，之后用3M的CH3COONa、无水乙醇浓缩多拷贝pPICZαA-mPlg。同时用0 ℃无菌1M的山梨醇和无菌水制备感受态毕赤酵母。

1.2.4 人微小纤溶酶原基因在毕赤酵母中的表达 使用电转化将重组质粒导入感受态毕赤酵母中，在含有博来霉素的YPDS中培养，用菌落PCR鉴定阳性重组子，将其命名为PCP4PLG。然后把PCP4PLG接种到 BMGY培养基中，培养至OD600在2～5之间时加入终浓度为0.5 %的无水甲醇，继续培养72 h，每24 h取菌液，2000 r/min离心，取适量上清液跑十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，鉴定是否有目的蛋白的表达。

1.2.5 人微小纤溶酶原的活性检测 使用发色底物法S-2403(pyroGlu-Phe-Lys-pNA·HCl)在波长为405 nm处检测发色底物S-2403的吸光度，从而达到检测人微小纤溶酶原的活性效果，将甲醇诱导4 d后的毕赤酵母菌液离心获得的上清液作为样品，长白山白眉蝮蛇蛇毒中提取的蛋白分解酶为标品，尿激酶作为人微小纤溶酶原激活剂，50 mM Tris-HCl pH7.4作为缓冲液，37 ℃在96孔板中反应。S-2403使用的浓度是0.3 mM，人微小纤溶酶原的检测终浓度在1～10 nM。

图1 人微小纤溶酶原多拷贝基因构建Fig.1 Constructing the mutiple copy expression vectors

1.2.6 甲醇添加比对人微小纤溶酶原表达的影响 选取上述实验得到最高活性的PCP4PLG，将其接种至BMGY培养基中，待其生长至对数生长期，以0.25 %、0.5 %、1 %、2 %、4 %的甲醇终浓度进行诱导培养，每培养24 h分别加入同样量的甲醇，连续培养4 d后收集发酵液，取1 mL发酵液离心后跑SDS-PAGE电泳，并检测其活性，分析实验结果得到甲醇的最适添加比。

1.2.7 pH对人微小纤溶酶原表达的影响 配制磷酸钾缓冲液pH梯度为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的BMGY培养基，将工程菌接种至培养基中，待其生长至对数生长期，加入上述实验得到的最佳甲醇添加比的甲醇溶液进行诱导培养，连续培养4 d后收集发酵液，取1 mL发酵液离心后跑SDS-PAGE电泳，并检测其活性，分析实验结果得到最适pH值。

1.2.8 温度对人微小纤溶酶原表达的影响 选取上述实验得到最高活性的PCP4PLG，将其接种至BMGY培养基中，待其生长至对数生长期后加入甲醇，然后在温度梯度为25、30、35 ℃的摇床恒温培养箱中培养。培养6 d后收获发酵液，取1 mL发酵液离心后跑SDS-PAGE电泳，并检测其活性，分析实验结果得到最佳培养温度。

1.2.9 溶氧量对人微小纤溶酶原表达的影响 选取上述实验得到最高活性的PCP4PLG，将其接种至BMGY培养基中，待其生长至对数生长期后加入甲醇，然后在150、200、250、300 r/min 的摇床恒温培养箱中培养。培养6 d后收获发酵液，取1 mL发酵液离心后跑SDS-PAGE电泳，并检测其活性，分析实验结果得到最佳摇床转速。

1.2.10 发酵周期对人微小纤溶酶原表达的影响 选取上述实验得到最高活性的PCP4PLG，将其接种至BMGY培养基中，待其生长至对数生长期加入无水甲醇然后分别在诱导1、2、3、4、5、6 d收集发酵液，取1 mL发酵液离心后跑SDS-PAGE电泳，并检测其活性，分析实验结果得到最佳发酵周期。

1.2.11 纯化 将工程菌在上述得到的最佳发酵条件中培养并收集，将发酵液在4 ℃、8000 r/min进行离心10 min。然后收集上清液用3 kDa超滤膜进行浓缩，使其体积为原来的1/10。SP-Sepharose FF 层析柱进行平衡，平衡时用pH 6.0，0.025 mol/L柠檬酸缓冲液，然后将超滤浓缩的发酵液用pH 6.0，0.025 mol/L柠檬酸缓冲液稀释3倍后上样。将上述溶液上样后，用pH 6.0，0.025 mol/L柠檬酸缓冲液冲洗柱子到第1个峰结束。再用pH 6.0，0.025 mol/L柠檬酸缓冲液和pH 6.0，0.025 mol/L柠檬酸缓冲液含1 mol/L的NaCl溶液进行洗脱。将收集的各组分跑SDS-PAGE电泳，并检测其活性。

2 结果与分析

2.1 人微小纤溶酶原基因与pPICZαA质粒的连接后用BglⅡ酶切

pPICZαA-mPlg质粒被BglⅡ酶切后，1 %的琼脂糖凝胶电泳分析产物，人微小纤溶酶原基因为700 bp左右，pPICZαA为3.6 kb，重组的pPICZαA-mPlg为4.3 kb。在电泳胶上显示有4000 bp多的电泳条带，实验结果与预测结果一致，表明质粒构建成功(图2)。

康熙十四年十月十三日，幸盘山诸寺，皆赐金。 智朴和尚呈《接驾诗二首》。康熙二十五年十二月一日，康熙再次幸临盘山盘谷寺，赐诗，智朴作《丙寅季冬一日驾幸青沟应制诗》如下：

2.2 多拷贝载体双酶切后核酸电泳结果

pPICZαA-4mPlg被BglⅡ和BamHⅠ双酶切后，1 %的琼脂糖凝胶电泳分析产物。一个人微小纤溶酶原的表达元件是2436 bp，4拷贝的人微小纤溶酶原为9744 bp。1～4号样品中，都有一条接近10 000 bp的4拷贝条带和3.6 kb的载体条带。实验结果与预测结果一致，表明质粒构建成功(图3)。

M: DNA marker DL10000;1：pPICZαA-mPlg digested with BglⅡ图2 重组蛋白表达载体构建Fig.2 Construction of expression vector of the recombinant protein

M:DNA marker DL10000; 1～4：BglⅡ和BamHⅠ双酶切后的4拷贝重组蛋白表达载体图3 4拷贝重组蛋白表达载体构建Fig.3 Construction of 4 copys expression cassette vector of the recombinant protein

2.3 转化到酵母中的菌落PCR鉴定

pPICZαA-4mPlg转化到酵母后，1 %的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。从图4可知，1、3、4、6-15都有条带，2号为pPICZαA所 PCR的产物，1号为pPICZαA-4mPlg的PCR产物，除5号其他样品跑出来的电泳条带均与1号相同为1400 bp，实验结果与预测结果一致，转化成功。

2.4 SDS-PAGE电泳结果

12 %SDS-PAGE电泳结果显示，1～7号泳道可见相对分子质量为29 kDa，1～6号泳道为4拷贝表达载体转化子；7号泳道为单拷贝表达载体转化子；8号泳道为不含人微小纤溶酶原基因但是有pPICZαA 的毕赤酵母，9号泳道为1号样品加入甲醇诱导剂之前的菌液。8、9泳道在29 kDa都没有条带，1～7号泳道毕赤酵母在加入甲醇溶液后，都产生人微小纤溶酶原大小的目的蛋白大小与预期相符合，且单拷贝蛋白电泳条带明显比多拷贝电泳条带淡很多，说明多拷贝表达量高。

2.5 发酵周期对人微小纤溶酶原产量的影响

从图6和7可知，PCP4PLG被甲醇诱导1～6 d内蛋白表达量随着时间的增加而增加，当甲醇诱导6 d后人微小纤溶酶原的产量最高。

M:DNA marker DL10000;1～14:pPICZαA-4mPlg转化到酵母后的PCR产物,15:4拷贝表达质粒载体的PCR产物图4 菌落PCR筛选阳性克隆Fig.4 PCR screening positive clone

M:Protein marker;1～6：4拷贝表达载体转化子; 7：单拷贝表达载体转化子; 8：含pPICZαA 的毕赤酵母; 9：诱导前样品图5 培养基上清液目标蛋白蛋白质电泳结果Fig.5 SDS-PAGE peofile of expressed protein

1：诱导前;2：不含目的基因酵母诱导6D;3：诱导1D;4：诱导2D;5：诱导3D;6：诱导4D;7：诱导5D;8：诱导6D图6 1 %甲醇不同诱导时间对人微小纤溶酶原表达的影响Fig.6 Effect of different induction time of 1 % methanol on expressing the microplasminogen

图7 诱导天数对人微小纤溶酶原活性的影响Fig.7 Effect of induction days on microplasminogen activity

1：0.25 %甲醇;2：0.5 %甲醇;3：1 %甲醇;4：2 %甲醇;5：3 %甲醇;6：诱导前图8 诱导剂浓度对人微小纤溶酶原表达的影响Fig.8 Effect of different induction concentration of methanol on expressing the microplasminogen

2.6 诱导剂浓度对人微小纤溶酶原产量的影响

从图8～9可知，PCP4PLG被不同浓度甲醇持续诱导4 d后的电泳结果和活性检测显示。甲醇终浓度为2 %，产量最高，活性最高。

2.7 pH对人微小纤溶酶原产量的影响

从图10～11可知，PCP4PLG在磷酸钾缓冲液pH为3 、4、5、6、7中被甲醇诱导4 d后的发酵样品。pH为7时，活性最高。

图9 甲醇终浓度对人微小纤溶酶原活性的影响Fig.9 Effect of final concentration of methanol on microplasminogen activity

1：pH3；2：pH4；3：pH5；4：pH6；5：pH7；6：pH6不含目的基因酵母；8：诱导前图10 pH对人微小纤溶酶原表达的影响Fig.10 Effect of different pH on expression the microplasminogen

图11 pH对活性的影响Fig.11 Effect of pH on microplasminogen activity

2.8 不同OD600诱导对人微小纤溶酶原产量的影响

1: OD600 =2;2: OD600 =3;3: OD600 =5;4:OD600 =6;5:OD600 =8;6: OD600 =10;7: OD600 =12;8: 诱导前;9:不含目的基因酵母OD600图12 不同OD600添加甲醇对人微小纤溶酶原表达的影响Fig.12 Effect of different OD600 add methanol on expressing the microplasminogen

图13 OD600对活性的影响Fig.13 Effect of OD600 on activity

1: r/min=150;2: r/min=175;3: r/min=200;4:r/min=225;5:r/min=250;6: r/min=275;7: r/min=300;8: 诱导前;9:不含目的基因酵母r/min=250图14 不同转速对人微小纤溶酶原表达的影响Fig.14 Effect of different rooting speed on expression the microplasminogen

2.9 溶氧量对人微小纤溶酶原产量的影响

PCP4PLG在不同转速下甲醇诱导4 d后的发酵样品。由图14～15可知，人微小纤溶酶原的产量随溶氧量的增高而增强。考虑到发酵容器的容量有限，若是转速越高，容器内的发酵液所受到离心力越大而导致发酵液容易飞溅或污染。所以仅考虑250 r/min为最适溶氧量。

图15 转速对活性的影响Fig.15 Effect of rooting speed on microplasminogen activity

1:r/min=24 ℃;2:r/min=26 ℃ 3: r/min=28 ℃;4:r/min=30 ℃;5:r/min=32 ℃;6: r/min=34 ℃;7: r/min=36 ℃;8: 诱导前;9:不含目的基因酵母30 ℃图16 不同温度对人微小纤溶酶原表达的影响Fig.16 Effect of different temperature on expression the microplasminogen

图17 温度对活性的影响Fig.17 Effect oftemperature on microplasminogen activity

2.10 温度对人微小纤溶酶原产量的影响

PCP4PLG在不同温度下甲醇诱导4 d后的发酵样品。由图16～17可知，PCP4PLG在30 ℃表达人微小纤溶酶原产量最佳。

表1 样品稀释80倍组吸光度与活性浓度

2.11 蛋白纯化SDS-PAGE及活性检测

由表1和图18可知，峰内和洗脱液在29 kDa有很明显的电泳条带，在峰内的样品和洗脱液都有活性，代表人微小纤溶酶原纯化成功，蛋白的纯度接近90 %，且测得的活性高达336 U/mL且蛋白回收率为69 %。

3 结 论

国内的沈俊卿等[11]表达Plg C 端530～790位间的261个氨基酸残基组成的肽链，在大肠杆菌中表达。由于大肠杆菌在蛋白翻译后不能对纤溶酶原进行正常折叠，需要体外用半胱氨酸复性但是体外复性可能形成错误折叠，得到有活性的人微小纤溶酶原含量很不理想，而且耗时很长。宋钢等[12]在毕赤酵母中成功表达含有261个氨基酸的人微小纤溶酶原且有活性，但没有具体说明其产量。Rongzeng Liu[13]在毕赤酵母中成功表达出含有261个氨基酸序列的人微小纤溶酶原，在5 L的发酵罐中，超过40h的诱导酵母分泌的蛋白含量达到1.88 g/L，上清液的活性单位达到7.9 U/mL。国外的Kishore k等[14]，成功表达在信号肽的作用下从毕赤酵母中分泌出来的不含五环结构的人微小纤溶酶原，并测定其活性、氨基酸序列等。Frans Aerts等[15]，在毕赤酵母中表达人纤溶酶原C端249个氨基酸序列，并用猪眼睛做实验测定其水解层粘蛋白、纤维连接蛋白的活性。

研究人微小纤溶酶原为未来研究其结构和机制提供条件。通过发酵条件优化得到PCP4PLG的最适pH值为7，最适温度为30 ℃和最佳甲醇添加比为2 %，摇床转速在250 r/min，在酵母生长浓度为1时添加甲醇持续诱导6 d，毕赤酵母表达人微小纤溶酶原的产量最高且发酵液活性为90 U/mL，进行SP-Sepharose fast flow凝胶层析后的蛋白液活性为336 U/mL，为后续进行大规模表达人微小纤溶酶原打下了基础。

4 讨 论

不同物种对遗传密码子具有一定的偏好性，当酵母表达非自身基因时，某些稀有密码子的出现可能限制细胞中氨酰tRNA对氨基酸的正常运转而导致翻译的提前终止，此外，不恰当的 AT 比例及分布也会明显降低表达水平[16]。因此，找到人微小纤溶酶原的氨基酸序列，需要通过软件设计毕赤酵母偏爱的人微小纤溶酶原的cDNA序列。

1: 峰内;2: 峰内;3: 穿透液;4:洗脱液;5:发酵液 图18 不同纯化阶段的人微小纤溶酶原含量Fig.18 Human microplasminogen content in different purification stages

毕赤酵母SMD1168为甲醇快利用型菌株，其同时含有编码醇氧化酶AOX1 和 AOX2 基因。一般情况下，分泌蛋白表达选择AOX1为启动子，其表达出来的蛋白活性相对于AOX2为启动子的要高一些[17]。而且毕赤酵母SMD1168为组氨酸脱氢酶缺陷菌株，可以利用组氨酸来筛选重组子。蛋白酶缺陷型的宿主菌蛋白含量少，可以减少目的蛋白的降解[18]。

载体选用pPICZɑA，其中含有在大肠杆菌可以扩增的原核启动子，同时含有5’AOX1 启动子、3’AOX1终止子。多克隆位点、抗性筛选标计、线性化酶切位点、C 末端聚组氨酸标签，以便于外源基因通过质粒整合到酵母基因组并进行筛选、表达，也有利于外源蛋白的检测和纯化[19]。

人微小纤溶酶原的表达及活性鉴定。在重组子被筛选出来后，酵母不需要很细化的培养基成分只需要用BMGY培养基就可以来培养及诱导人微小纤溶酶原的表达。通过诱导前和诱导后的上清液SDS-PAGE便可很直观的看出是否有目的蛋白的表达。在有目的条带的前提下进行发色底物测定，通过测定人微小纤溶酶原水解发色底物使其产生淡黄色的对硝基苯胺在波长为405 nm的吸光度来确定人微小纤溶酶原活性强弱。

外源基因多拷贝能使串联的多个目的基因同时进行转录与翻译，从而达到提高蛋白产量的效果[20]，但少部分研究也表明，单拷贝与多拷贝间并无明显差异，甚至多拷贝产量更低[21]。这可能是由于外源mRNA 翻译效率降低，也可能是因为蛋白质通过内质网不能正确折叠或者折叠效率低造成的。