大鲵皮肤色素的性质及功能研究

杨慧，陈德经，2，*，陈海涛，董梦尧

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中723001；2.陕西理工大学陕西省资源生物重点实验室，陕西汉中723001；3.汉中龙鲵生物工程股份有限公司，陕西汉中723001）

大鲵（Andrias davidianus）俗称“娃娃鱼”，属有尾目、隐鳃鲵科，是鱼类和爬行动物之间的代表两栖类过渡类型，有“生物界活化石”的美称[1]，大鲵是传统名贵药用动物之一，其肌肉、内脏、骨骼、表皮及皮肤分泌物均可入药，目前大鲵体内已发现50 多种天然活性物[2]。近年来，人们对大鲵的研究主要集中在大鲵肉和大鲵皮肤黏液等方面，有关大鲵皮肤黑色素的研究极少。

黑色素是酚类或吲哚类物质通过氧化聚合形成的高分子生物色素，与蛋白质结合紧密，其不溶于水、酸和常见的有机溶剂，可溶于氢氧化钠，三乙胺等碱性溶液[3]。自然界的黑色素有两类，一类是真黑色素，含氮不含硫，呈棕色或黑色；另一类是脱黑色素，既含氮又含硫，通常呈黄色或微红棕色[4]。动物黑色素食品行业有着广泛的用途，可添加到抗菌剂、防晒剂和黑发素等产品中。在动物天然色素的开发利用上，主要集中在乌鸡、乌贼、黑蚂蚁[10-12]等动物，两栖类动物黑色素的研究鲜见报道。

本试验用碱溶酸沉法对大鲵皮肤黑色素提取纯化，采集其紫外-可见、红外谱图，以此对大鲵皮黑色素进行定性分析。同时，测定大鲵皮肤黑色素的稳定性、抗氧化、抗紫外及抗菌活性，以期为大鲵皮肤黑色素的综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

大鲵皮：汉中龙鲵生物工程股份有限公司。

乌贼黑色素（CAS：8049-97-6）：美国sigma 公司；溴化钾（色谱纯）：天津天光光学仪器有限公司；抗坏血酸：天津市天新精细化工开发中心；硫酸亚铁、水杨酸：天津市北联精细化学品开发有限公司；邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷：上海源叶生物科技有限公司；氯化钠、氢氧化钠、石油醚、过氧化氢、甲醇、95%乙醇、盐酸、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、氨水、三乙胺、CuSO4、MgCl2、CaCl2、Na2SO4、FeCl3、ZnCl2（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；牛肉膏、蛋白胨、琼脂：北京奥博星生物技术有限责任公司；柠檬酸：天津市百世化工有限公司；木瓜蛋白酶（酶活为1 000 U/mg）：北京鼎国生物技术有限责任公司；大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：陕西理工大学资源生物实验室菌种保藏中心；土霉素片：云南白药集团股份有限公司。

1.1.2 仪器与设备

BRUKER VERTEX 70 红外光谱仪：德国布鲁克有限公司；UV-1750 型紫外可见分光光度仪：日本岛津仪器公司；LC-800 低速离心机：科大创新股份有限公司；BGZ-76 电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司；JA5003 电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DZF-6050 型真空干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；601 超级水浴锅：金坛市瑞华仪有限公司；KQ5200DE 型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；SX-700 高压蒸汽灭菌锅：TOMY SEIK 公司；HMS-350 小型旋涡振荡器：天津市恒奥科技发展有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 大鲵皮脱色、色素提取及纯化工艺

大鲵皮→浸盐水（6 %NaCl，60 min）→柠檬酸脱色（0.1 %，45 ℃水浴90 min）→色素去除→色素称量→酶解蛋白质（5 %木瓜蛋白酶，55 ℃水浴4 h）→离心（4 000 r/min，5 min）→脂肪溶解（石油醚溶解2次）→抽滤→碱溶（6 %NaOH）→离心（4 000 r/min，10 min）→取上清液→酸沉（HCI 调pH 值至1.0）→沉淀物→重复碱溶酸沉操作2 次～3 次→收集沉淀物→水洗沉淀物→真空干燥→大鲵皮黑色素。

1.2.2 大鲵皮色素溶解度的测定

分别称取1 mg 大鲵皮黑色素于具塞试管中，在28 ℃条件下加入10 mL 不同种类的酸、碱、有机溶剂，在振荡器上充分混匀，观察其溶解性，再将试管置于超声清洗器中超声30 min，观察其溶解性有无变化。

1.2.3 大鲵皮色素定性分析

1.2.3.1 大鲵皮色素的紫外-可见光光谱

取大鲵皮色素若干，在常温下溶于4%的氢氧化钠溶液中，制得大鲵皮色素碱溶液，以UV-VIS 型紫外分光光度计测定200 nm～800 nm 色素溶液的吸光值，绘制吸光值随波长变化的曲线图。

1.2.3.2 红外光谱分析

采用溴化钾压片法：将溴化钾结晶块在玛瑙钵体中研成细粉，准确称取150 mg 溴化钾粉末两份，一份加入纯化后色素样品1 mg 研细混匀，另一份作为空白用以扣除本底，分别进行压片。在傅立叶变换红外光谱仪上4 000 cm-1～400 cm-1区间测定红外光谱。

1.2.4 大鲵皮色素的稳定性分析

1.2.4.1 大鲵皮色素的热稳定性

取大鲵皮色素溶液于具塞试管中，分别放在28、40、60、80、100 ℃恒温水浴锅中，然后依次测定0、2、4、6、8 h 黑色素溶液在360 nm 处的吸收值。

1.2.4.2 大鲵皮色素的光稳定性

取大鲵皮色素溶液于具塞试管中，在自然光和阴暗处分别放置7、14、21 d，观察溶液的颜色变化，并在360 nm 处检测其吸光值。

1.2.4.3 对金属离子的稳定性分析

取大鲵皮色素色素溶液5 mL，分别用配置好的0.5 g/L 的CuSO4、MgCl2、CaCl2、FeCl3和ZnCl2定容至25 mL，依次测定10 min、12、24、48 h 大鲵皮色素溶液在360 nm 处的吸光值。

1.2.5 大鲵皮色素抗氧化活性检测

1.2.5.1 清除超氧阴离子自由基（O2-·）的检测方法

取不同质量浓度的样品溶液1 mL，加入0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH=8.2）4.5 mL，在25 ℃水浴10 min后，加入3 mmol/L 邻苯三酚溶液0.2 mL 混匀，在25 ℃水浴5 min，最后加入8 mmol/L HCl 终止反应，在波长299 nm 处测定其吸光度值，以4%NaOH 溶液调零，抗环血酸为阳性对照，平行测定吸光度值3 次。按式1 计算超氧阴离子自由基清除率：

式中：A0为不加样品溶液，加入邻苯三酚的溶液吸光度；A1为加入样品溶液和邻苯三酚的溶液吸光度；A2为加入样品溶液但不加邻苯三酚的溶液吸光度。

1.2.5.2 清除羟基自由基（·OH）的检测方法

向试管中加入不同质量浓度的样品溶液2 mL，9 mmol/L 硫酸亚铁2 mL、9 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液2 mL，最后加入9 mmol/L 双氧水2 mL 启动反应，振荡混匀，37 ℃水浴保温30 min，冷却至21 ℃后离心（5 000 r/min，10 min），取上清液在波长510 nm 处每隔30 s 测定其吸光度值，以4%NaOH 溶液调零，抗环血酸为阳性对照，平行测定吸光度值3 次。按式2 计算羟自由基的清除率：

式中：A0为不加样品溶液，加入水杨酸-乙醇显色剂的溶液吸光度；A1为加入样品溶液和水杨酸-乙醇显色剂的溶液吸光度；A2为加入样品溶液但不加水杨酸-乙醇显色剂的溶液吸光度。

1.2.6 大鲵皮色素抗紫外性

用紫外-可见分光光度计分别扫描二氧化钛（阳性对照）、大鲵皮色素溶液、乌贼色素溶液和超纯水（阴性对照）在200 nm～280 nm、280 nm～320 nm、320 nm～400 nm3 个波长范围的吸光值，然后生成曲线。200 nm～280 nm 为紫外短波区域（ultraviolet radiation c，UVC），280 nm～320 nm 为紫外中波区域（ultraviolet radiation b，UVB），320 nm～400 nm 为紫外长波区域（ultraviolet radiation a，UVA），吸光值越大，透射率越低，则阻光性越好，抗紫外能力也越强[13]。

1.2.7 大鲵皮色素的抗菌性

牛肉膏蛋白胨培养基配制：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15.0 g～20.0 g，水1 000 mL，pH 7.4～7.6，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。

参考陈德经等[14]的滤纸片法并稍作修改。先将大鲵皮黑色素和土霉素分别用无菌的0.01%氢氧化钠配制成浓度为1.5 mg/mL 的溶液，然后活化供试菌种，配置菌悬液。在超净工作台中将灭菌后的牛肉膏蛋白胨培养基倒入无菌培养皿中，待培养基凝固后，用移液枪吸取200 μL 稀释10 倍的菌悬液对号放入平皿中，涂布棒涂布均匀。A 培养皿接种大肠杆菌，B 培养皿接种铜绿假单胞菌，C 培养皿接种藤黄微球菌，D 培养皿接种金黄色葡萄球菌。

将6 mm 的圆形灭菌滤纸片分别在大鲵皮色素溶液、土霉素溶液、水及0.01%氢氧化钠中浸泡30 min，而后用无菌镊子将滤纸片贴于涂菌平板对应位置上。标记1 为0.01%氢氧化钠，标记2 为大鲵皮黑色素，标记3 为土霉素，标记4 为水。每种细菌重复3 个抑菌平板。平板在37 ℃培养箱培养24 h，测定滤纸片平均抑菌圈直径，按下列公式计算抑菌力。

1.2.8 数据分析

2 结果与分析

2.1 大鲵皮色素溶解性质分析

大鲵皮黑色素溶解性质的结果见表1。

表1 大鲵皮黑色素在不同溶剂中的溶解性Table 1 Solubility of melanin from gaint salamander skin pigment in different solvents

由表1可以看出，大鲵皮黑色素难溶于有机溶剂，微溶于水，易溶于偏碱性的极性溶液。这与现已报道的乌鸡、乌贼、黑蚂蚁、林蛙卵等黑色素的溶解性一致。

2.2 大鲵皮色素的定性结果分析

2.2.1 大鲵皮色素的紫外（ultraviolet-visible，UV-VIS）光谱

大鲵皮色素的紫外光谱图见图1。

图1 大鲵皮色素的紫外光谱图Fig.1 Ultraviolet visible spectrum of giant salamander skin pigment

黑色素多聚物因其高度的共轭效应而产生广谱的光吸收特性。由图1可知大鲵皮黑色素在紫外区的最大吸收波长为214 nm，在可见光区没有特征吸收峰，在200 nm～400 nm 波长范围内吸收值随波长的增大而减少。这与报道的不同来源动物黑色素的最大吸收波长在210 nm 左右一致。宋茹等[15]用酶解法制备的鱿鱼黑色素在220 nm 有特征吸收峰。衡惠等[16]用碱溶酸沉法提取的黑蚂蚁黑色素的最大吸收峰在212 nm 处。

2.2.2 大鲵皮色素的红外光谱谱图

红外光谱是一种化合物结构鉴定的有效方法。大鲵黑色素的傅里叶红外结构图如图2所示，其与乌鸡黑色素红外图谱的对比结果如表2所示。

图2 大鲵皮色素红外光谱图Fig.2 Infrared spectrum of giant salamander skin pigment

表2 大鲵黑色素和乌鸡黑色素峰位的异同Table 2 Similarities and differences of peak location between gaint salamander and black chicken

由图2可知，大鲵黑色素在1 653 cm-1处的强吸收峰推测其有黑色素典型的苯醌类结构，3 296 cm-1和1 543 cm-1处的吸收峰推测有吲哚结构，617 cm-1推测其可能含硫元素，红外图谱显示大鲵黑色素为具有吲哚结构的含硫异聚物。由表2可知，大鲵黑色素与乌鸡黑色素主要特征吸收峰所处位置非常接近，说明大鲵皮黑色素与乌鸡黑色素的主要功能基团基本一致。

2.3 大鲵皮色素的稳定性结果分析

2.3.1 大鲵皮色素的光稳定性分析

鲵皮肤色素的光稳定性见表3。

表3 大鲵皮肤色素的光稳定性Table 3 Photostability of giant salamander skin pigments

光稳定性试验过程中，随着试验天数的增加，可观察到光照下的大鲵皮色素溶液颜色略微变淡，而在阴暗处的溶液颜色基本无变化。测量其吸光度值可知，光照处和阴暗处的溶液吸光度逐渐降低，到第21天时，吸光度分别为0.160 和0.165，降低了0.013 和0.008。光照对大鲵皮色素稳定性影响较小，表明大鲵皮黑色素有良好的光稳定性。

2.3.2 大鲵皮色素的热稳定性

大鲵皮色素的热稳定性见表4。

表4 大鲵皮色素的热稳定性Table 4 Thermal stability of giant salamander skin pigments

热稳定性试验过程中，随着温度不断升高，大鲵皮色素的溶解度也逐渐增加，表现为紫外吸光值的增加；大鲵皮色素溶液在室温（28 ℃）～100 ℃保持8 h 后其吸光值基本保持不变。表明大鲵皮色素具有良好的热稳定性。

2.3.4 大鲵皮色素金属离子稳定性

大鲵皮肤色素金属离子稳定性见表5。

表5 大鲵皮肤色素金属离子稳定性Table 5 Metal ion stability of giant salamander skin pigments

由表5可知，在大鲵皮色素溶液中加入不同金属离子后，产生不同程度的变化。其中Mg2+，Zn2+在与大鲵皮色素共存的情况下较稳定，且颜色没有发生变化。FeCl3在水中电离出的Fe3+与大鲵皮色素发生络合反应，放置48 h 后，溶液颜色由淡红色变成深砖红色，振荡后静置有少许不溶物析出，这是由于金属离子铁有较强的配位能力，与大鲵皮色素中较活泼的官能团形成络合，致使其产生变化。铁离子对大鲵黑色素稳定性的影响较大，在贮藏应用中应避免铁离子的接触。苏玉春等[18]研究了Ca2+、Na+、Zn2+、Mg2+、Al3+和Fe3+等对林蛙卵黑色素稳定性的而影响，发现铁离子最影响黑色素稳定性。

2.4 大鲵皮色素抗氧化结果

2.4.1 清除超氧阴离子自由基（O2-·）的检测结果

超氧阴离子自由基（O2-·）清除率结果见图3。

图3 超氧阴离子自由基（O2-·）清除率Fig.3 O2-·free radical scavenging rate

从图3可以看出，在试验设置的质量浓度范围内大鲵皮色素对超氧自由基均有一定的清除作用，其清除能力与质量浓度成正比。当浓度在2.5 mg/mL 时，大鲵皮色素对超氧阴离子自由基的清除率为30.51%，而VC对超氧自由基的清除能力较强，在浓度2 mg/mL时清除率就已超过90%。

2.4.2 清除羟基自由基（·OH）的检测结果

大鲵皮色素对羟自由基的清除率曲线见图4。

图4 大鲵皮色素对羟自由基的清除率曲线Fig.4 Scavenging rate of hydroxyl radicals

从图4可知，大鲵皮色素在试验设置的质量浓度范围内对羟自由基的清除作用随浓度的增大而增强，但清除作用显然均没有VC高。在浓度为0.5 mg/mL～2.0 mg/mL 时，随着浓度的增加，大鲵皮色素对羟自由基的清除率显著升高，但当浓度高于2 mg/mL 时，随浓度的增加，清除率缓慢增加。浓度在2.5 mg/mL 时，大鲵皮色素对羟基自由基的清除率为54.17%，而VC在浓度1.5 mg/mL 时清除率达到93%以上。

吴世玉等[19]测定了林蛙卵黑色素的抗氧化性，表明林蛙卵黑色素具有较强的抗氧化活性，对超氧阴离子的IC50为1.250 mg/mL，对羟自由基的IC50为0.662 mg/mL。陈士国等[20]测定了鱿鱼墨黑色素对羟基自由基与超氧阴离子自由基的清除活性，结果表明其清除超氧阴离子自由基和羟基自由的IC50分别为0.015 mg/mL 和0.2 mg/mL。动物黑色素抗氧化性大小因动物种类而存在差异，种类不同，其抗氧化活性的高低也不同。

2.4 大鲵皮色素抗紫外性

大鲵皮色素对不同波长紫外光的吸收情况如图5所示。

图5 大鲵皮色素对不同波长紫外线的吸收Fig.5 Absorption of ultraviolet of different wavelengths by the giant salamander skin pigments

由图5可知，大鲵皮黑色素对不同波长的紫外线均有吸收作用，紫外线波长越长，抗紫外作用越弱。在紫外短波区的200 nm～230 nm 范围内，大鲵皮黑色素吸光值高于二氧化钛，在中波区和长波区，其吸光值介于二氧化钛和乌贼黑色素之间，说明大鲵皮黑色素对紫外线的吸收主要集中在短波区。

2.5 大鲵皮色素抗菌性

大鲵皮色素对不同菌种的抑菌圈大小如表6所示。

表6 大鲵皮色素对不同菌种的抑菌圈直径Table 6 Bacteriostasis circle diameters of giant salamander skin pigments to different strains cm

由表6可以看出，大鲵皮色素对大肠杆菌的抑菌圈和土霉素较接近，说明大鲵皮色素对大肠杆菌有明显的抑菌作用，抑菌效果为土霉素抑菌效果的75%；大鲵皮色素对铜绿假单胞菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈均为0，说明大鲵皮色素无抑制铜绿假单胞菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌效果。

Yuspihana F 等[6]研究了墨鱼黑色素对大肠杆菌的抑菌力，表明黑色素对大肠杆菌有较强的抑制作用，其抑菌活性可达99.99%。这与本文中大鲵皮肤黑色素对大肠杆菌有较强抑菌力的结果一致，但黑色素对大肠杆菌抑菌力的大小随动物种类不同而不同。

3 结论

对大鲵皮黑色素的紫外-可见光谱、红外光谱进行采集，得出大鲵皮色素的紫外最大吸收峰在214 nm，为具吲哚结构的含硫异聚物。大鲵皮色素的光稳定性和热稳定性良好，受铁离子影响较大，其可以作为安全、无毒、稳定性好的天然色素使用，但在贮藏过程中要避免铁离子。

大鲵皮肤色素具有一定的保健功能，可将其添加到营养保健品、防晒品、美容护肤品和药品中，提升大鲵价值，延长大鲵产业链。