超声波辅助水酶法提取柚子籽油及其抗氧化性研究

叶 茂,邓毛程,严立逊,黄 莹,刘如运

(1.广东轻工职业技术学院 食品与生物技术学院, 广州 510300; 2.广东轻工职业技术学院 广东省特色调味品工程技术开发中心, 广州 510300)

柚子(CitrusgrandisOsbecko)是芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus)植物，在我国长江以南各省广泛种植，且单产和产量逐年增加。柚子皮和果实已经被广泛用于食品、化妆品、医药行业，如用果肉加工饮料，从柚子皮中提取色素、精油、果胶等[1-2]，但柚子加工的副产品柚子籽却未得到合理利用。柚子籽较其他柑橘类籽大，质量为柚子整果肉质量的0.1%～4.0%。柚子籽含有粗脂肪、蛋白质、膳食纤维、黄酮类化合物、柠檬苦素类似物、矿物元素、维生素等多种化学成分，其油脂含量丰富，一般在40%以上，富含亚油酸、油酸等，有较高的实用价值，可以作为新的油脂资源[3-4]。

目前，关于柚子籽油的提取方法主要有超声波辅助提取法[5]、有机溶剂萃取法[6]。水酶法提油工艺条件温和，能够很好地保护油脂中营养物质，迄今国内外研究水酶法提油工艺研究涉及芝麻、油菜籽、油茶籽、红花籽等多种油料作物[7-9]。为此，本文采用超声波辅助水酶法提取柚子籽油，对酶解条件进行优化，确定柚子籽油提取的最优工艺参数，并比较维生素C、白藜芦醇与柚子籽油的抗氧化性，以期为柚子籽油的综合开发利用提供一条新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

柚子籽，购自超市；纤维素酶(5 000 U/g)、中性蛋白酶(10 000 U/g)，购自广州大久生物科技有限公司；维生素C(分析纯)，购自广州化学试剂厂；白藜芦醇，购自北京诺其雅盛生物科技有限公司。

FW135型中草药粉碎机，HH-4数显恒温水浴锅，KQ-250DB型数控超声波破碎仪，LD5-2A型离心机，SP-756P紫外-可见分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 柚子籽油的提取

将柚子籽恒温干燥后，粉碎。称取5.0 g柚子籽粉置于三角瓶中，加入40 mL蒸馏水，置于超声波破碎仪中进行预处理(130 W，15 min，45℃)，然后取出调节pH，加入复合酶制剂(纤维素酶和中性蛋白酶)，在一定温度下酶解一定时间。酶解结束后，在沸水浴中灭酶10 min，离心(12 000 r/min，15 min)，收集上层游离的油，称量，按下式计算柚子籽油得率。

1.2.2 羟自由基清除率的测定

采用胡翠珍等[10]的方法并改进。将1.8 mmol/L硫酸亚铁溶液、1.8 mmol/L过氧化氢溶液、1.8 mmol/L 70%的水杨酸-无水乙醇溶液(1.8 mmol/L水杨酸-无水乙醇和1.8 mmol/L水杨酸溶液按1∶3混合)、一定质量浓度的试样按顺序加入到试管中，振荡反应10 min，以蒸馏水为参比，于510 nm处测定吸光度，按下式计算羟自由基清除率。

式中：A0为2 mL硫酸亚铁+2 mL水杨酸-无水乙醇溶液+5 mL蒸馏水+2 mL过氧化氢吸光度；Ai为2 mL硫酸亚铁+2 mL水杨酸-无水乙醇溶液+5 mL样品液+2 mL过氧化氢吸光度；Aj为2 mL硫酸亚铁+2 mL蒸馏水+5 mL样品液+2 mL过氧化氢吸光度。

1.2.3 超氧阴离子自由基清除率的测定

采用程德竹等[11]的方法并改进。取0.05 mol/L pH 9.0的Tris-HCl缓冲液4.5 mL，置于25℃水浴中预热20 min，分别加入1 mL试样和0.4 mL 25 mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5 min，加入2.0 mL 2 mol/L HCl溶液终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，在320 nm处测定吸光度A1，以等体积的蒸馏水代替试样，测定吸光度A0，按下式计算超氧阴离子自由基清除率。

1.2.4 数据处理

实验数据用SPSS20.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 酶添加量对柚子籽油得率的影响

在pH 7、酶解温度40℃、纤维素酶与中性蛋白酶比例1∶1、酶解时间30 min条件下，考察不同酶添加量对柚子籽油得率的影响，结果见图1。

图1 酶添加量对柚子籽油得率的影响

植物细胞壁是以纤维素为骨架，并与半纤维素、果胶及蛋白质等大分子结合而成。纤维素酶可有效降解植物细胞壁的纤维素骨架，蛋白酶可对细胞膜上的脂蛋白进行水解使其中油脂得以释放，还可对酶解过程中形成的、包裹在油滴外的蛋白膜进行降解，使油脂游离。从图1可以看出，当酶添加量为0.2%～2.0%(以柚子籽质量计，下同)时，柚子籽油得率随酶添加量提高逐渐增加，当酶添加量超过2.0%后，柚子籽油得率增加不明显，这与酶添加量对许多油脂得率的作用结果基本一致[12-13]。考虑到工业化生产成本，酶添加量选择2.0%。

2.2 pH对柚子籽油得率的影响

在酶添加量2.0%、酶解温度40℃、纤维素酶与中性蛋白酶比例1∶1、酶解时间30 min条件下，考察不同pH对柚子籽油得率的影响，结果见图2。

从图2可以看出，当pH为6时，柚子籽油得率达到最大值，为22.7%，在pH大于6时，柚子籽油得率下降，这可能与复合酶制剂的最适pH有关。故选定提取柚子籽油的最适pH为6。

图2 pH对柚子籽油得率的影响

2.3 酶解温度对柚子籽油得率的影响

在酶添加量2.0%、pH 6、纤维素酶与中性蛋白酶比例1∶1、酶解时间30 min条件下，考察不同酶解温度对柚子籽油得率的影响，结果见图3。

图3 酶解温度对柚子籽油得率的影响

从图3可以看出，当酶解温度为50℃时，柚子籽油的得率最高，达到26.6%。因此，酶解温度选择50℃。

2.4 纤维素酶与中性蛋白酶比例对柚子籽油得率的影响

在酶添加量2.0%、pH 6、酶解温度50℃、酶解时间30 min条件下，考察不同纤维素酶与中性蛋白酶比例对柚子籽油得率的影响，结果见图4。

图4 纤维素酶与中性蛋白酶比例对柚子籽油得率的影响

纤维素酶可有效降解植物细胞壁的纤维素骨架，蛋白酶可对细胞膜上的脂蛋白进行水解使其中油脂得以释放，纤维素酶与蛋白酶的比例可直接影响油的得率[14]。从图4可以看出，当纤维素酶与中性蛋白酶比例为2∶1时，柚子籽油得率最高，为28.6%。故选择纤维酶与中性蛋白酶比例为2∶1。

2.5 酶解时间对柚子籽油得率的影响

在酶添加量2.0%、pH 6、酶解温度50℃、纤维素酶与中性蛋白酶比例2∶1条件下，考察不同酶解时间对柚子籽油得率的影响，结果见图5。

图5 酶解时间对柚子籽油得率的影响

从图5可以看出，在15～60 min范围内，随着酶解时间延长柚子籽油得率不断增加，在酶解时间60 min时柚子籽油得率达到33.2%，但酶解时间超过60 min以后，柚子籽油得率基本不变。这说明酶解反应达到一定时间后，由于原料减少，得率趋于恒定，所以酶解时间选择60 min。

2.6 柚子籽油的抗氧化性

2.6.1 对羟自由基的清除作用(见图6)

图6 不同物质对羟自由基清除作用的比较

由图6可知，在低质量浓度20～40 μg/mL时，柚子籽油的羟自由基清除率低于维生素C和白藜芦醇，当质量浓度达到80～100 μg/mL时，柚子籽油与维生素C和白藜芦醇的羟自由基清除率基本一致；当质量浓度达到120 μg/mL及以上时，其羟自由基清除率显著高于维生素C和白藜芦醇。

2.6.2 对超氧阴离子自由基的清除作用(见图7)

图7 不同物质对超氧阴离子自由基清除作用的比较

从图7可以看出，柚子籽油与相同质量浓度的维生素C和白藜芦醇对超氧阴离子自由基的清除作用无显著差异。由此可见，柚子籽油与常见的抗氧化剂一样对超氧阴离子自由基具有较强的清除作用。推测柚子籽油含有较多的类黄酮、柠檬苦素等有效抗氧化成分。

3 结 论

以超声波辅助水酶法提取柚子籽油最佳工艺条件为：酶添加量2.0%，pH 6.0，酶解温度50℃，纤维素酶与中性蛋白酶比例2∶1，酶解时间60 min。在最佳工艺条件下，柚子籽油得率达到33.2%。

柚子籽油质量浓度为120 μg/mL及以上时，对羟自由基的清除能力高于维生素C和白藜芦醇，柚子籽油对超氧阴离子自由基的清除能力等同于相同质量浓度(1～10 mg/mL)的维生素C和白藜芦醇。因此，柚子籽油具有良好的抗氧化能力。