茶皂素纯化方法研究进展

唐珊珊，黄三萍，肖新生，刘 芳

(湖南科技学院 化学与生物工程学院，湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室，湖南 永州 425199)

茶皂素又名茶皂甙，广泛存在于山茶科植物中，是一类结构相近的齐墩果烷型五环三萜类皂苷混合物，由于分子中含有两性基团，可作为一种天然非离子型表面活性剂[1]。此外，茶皂素还具有抗菌[2-3]、抗渗消炎[4-5]、延缓动脉粥样硬化[6]、保护肠胃抑制酒精吸收[7]等多种生物活性，广泛应用于建材、化工、生物医药及食品等行业。

目前市场上的茶皂素主要还是以低含量为主，纯度不高、杂质含量较多，限制了茶皂素的开发利用，因此须采用适当的方法除去非茶皂素的杂质即进行茶皂素纯化。纯化是将多种物质的聚集体，通过物理[8]、化学[9]或生物[10]等方法，变成一类或一种物质的过程，通过对粗茶皂素进行纯化，可生产高纯度茶皂素。研究人员已认识到茶皂素纯化的重要性，并尝试了各种方法，但是目前茶皂素的纯化工艺尚不完善，导致茶皂素的工业化产品在医药及化妆等精细化工行业的应用受到一定的限制。因此，必须寻找简单、高效的纯化方法以提高茶皂素的药用价值及经济价值，避免资源的浪费。本文就已开展的各种纯化方法综述茶皂素纯化的研究进展，以期为茶皂素的纯化利用提供参考。

1 茶皂素基本性质

茶皂素(C57H90O28)属于三萜类皂素，由配基、配糖体和有机酸构成，化学结构比较复杂。其基本碳架和配基分别由齐墩果烷(Oleanane)和β-香树素(β-amyrin)衍生物构成，配糖体主要由葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖以及阿拉伯糖组成，有机酸由醋酸、肉桂酸、当归酸、惕各酸等成分组成。茶皂素配基与配糖体以甙键形式结合，与有机酸以酯基的形式结合[11]。由于组合单元体的多样性及组合方式的差异性，导致茶皂素成为一种结构相似的混合物。

茶皂素携有苦辛辣味，纯品在形态上呈柱状结晶，色泽为无色，具有强吸湿性，对甲基红呈酸性，基本理化性质如表1所示。

表1 茶皂素的理化性质

利用常规提取方法[12]从油茶饼粕中提取的茶皂素粗品通常含有多糖和蛋白类等杂质。这些杂质与茶皂素在理化性质上存在较大差异，具体表现在：在溶剂中的溶解度不同；与不同沉淀剂作用不同；与吸附剂的吸附能力不同；分子大小、相对分子质量及极性不同等。研究者们正是根据这些性质差异进行茶皂素纯化。

2 茶皂素纯化方法

2.1 重结晶法

根据茶皂素比多糖和蛋白类等杂质更易溶于含水乙醇，及其在含水乙醇中的溶解度随温度降低迅速下降的特点利用重结晶法进行茶皂素纯化。张海龙等[13]称取粗茶皂素加入到95%热乙醇液中，溶后趁热过滤，收集滤液，滤液缓慢降到室温后，置于冰箱4℃下静置一段时间，得到半透明结晶物，将此结晶物烘干后即得较高纯度的茶皂素。但是这种方法得率偏低，在工业化生产上存在不足。

2.2 萃取法

2.2.1 醇萃法

此方法是在水提法基础上的拓展改进，将得到的粗茶皂素提取液加入另外一种萃取剂转萃，即可获得纯度较高的茶皂素。赵元藩等[14]早在1996年报道了这种新的工艺“水提-醇萃法”，制备的茶皂素纯度为95%。曾韬等[15]在此基础上又进行了改进，提出 “一水二醇”法，采用95%乙醇为提取剂进行浸提，并以所得的粗茶皂素为原料，再用正丁醇萃取，在较优的工艺条件下制得的茶皂素纯度可达85%以上，且产品具有理想的色泽。陈秋平等[16]在进行茶皂素纯化研究时，重点比较了丙酮和正丁醇两种不同溶剂的纯化效果，结果表明前者纯化茶皂素产率低于后者，对环境污染大，并且价格也较高，所以用正丁醇纯化有明显优势。

李祥等[17]以实验室研制的茶皂素粗品为原料，对比探究了纯化剂分别为水饱和正丁醇和正丁醇时两者萃取效果，结果表明前者效果明显优于后者，这是因为正丁醇作为萃取剂时，会产生大量乳化层，导致难以分层，而用水饱和正丁醇乳化层会大大减少。当水饱和正丁醇用量为35 mL、pH为4、粗茶皂素质量分数为25%、萃取次数为3时，将3次的滤液合并，旋转蒸发，烘干后得纯度为97%的乳白色茶皂素产品。

醇萃法工艺简单、制备的产品收率和纯度都较高，适合进行工业化生产，值得推广。

2.2.2 双水相萃取法

根据茶皂素和水溶性杂质在双水相体系的上下相中分配情况的差异，进而达到纯化的目的。张团结等[18]采用丙醇/硫酸铵双水相体系对粗茶皂素进行萃取，优选硫酸铵和丙醇的质量分数分别为20%和23%，并在40℃、pH中性条件下进行萃取，茶皂素萃取率可达89.32%，质量分数由40.2%提高至78.12%，效果可观且分离速度快。吕琪[19]也采用丙醇/硫酸铵双水相体系对茶皂素进行纯化，在较优的条件下得到茶皂素平均含量为77.12%，纯化后的茶皂素在含量及颜色上均有大幅提升。

双水相萃取技术具有萃取条件温和、处理量大、萃取率高、两相分离快、能耗低等优点，但是因为同时一次使用两种溶剂对设备的要求较高。

2.3 生物纯化法

2.3.1 酶法

粗茶皂素中的杂质主要是多糖和蛋白类物质，由于这两种物质与茶皂素相互作用较强，导致分离难度较大，因此研究人员尝试采用选择性高的生物酶对多糖和蛋白类杂质进行水解去除，从而实现制备高纯度茶皂素。

游瑞云等[20]采用由纤维素酶与糖化酶按1∶2比例构成的组合酶进行粗茶皂素水解除杂，在组合酶用量0.5%、温度50～60℃、pH 6～7条件下水解12 h，可得到纯度接近90%的茶皂素。为进一步提高纯度，他们将酶水解得到的粗品加入丙酮，离心分离，烘干后最终得到的茶皂素纯度高达98.3%。

周红宇等[21]采用壳聚糖-蛋白酶联用纯化茶皂素，结果表明蛋白酶处理可显著提高茶皂素得率，这是因为其可降低粗品中蛋白质含量和壳聚糖絮凝时茶皂素损失。

2.3.2 发酵法

金月庆等[22]以水提得到的粗茶皂素为原料，加入的酶a、酶b用量分别为0.30%和0.35%，再按酵母液与待发酵液体积比为1∶10比例加入活化后的酵母，发酵一段时间后将发酵液过滤，滤液浓缩干燥即得茶皂素，其纯度可达73.1%。

生物纯化法纯化茶皂素工艺条件温和、对环境友好、选择性较高，但是操作过程较复杂，耗时较长。

2.4 沉淀法

沉淀作用包括一个新的凝结相的形成过程，和由于沉淀剂的使用导致某些离子生成难溶化合物进而沉积的过程。根据沉淀对象的不同，分为两类：一类是沉淀目标物茶皂素，一类是沉淀杂质。经沉淀法纯化得到的精制茶皂素纯度较高，但是此方法产率偏低，不适合工业生产。

2.4.1 沉淀杂质

使杂质沉淀的试剂主要有壳聚糖、乙醇、硫酸铝钾、聚三氯化铁等。刘尧刚等[23]选用80%乙醇为溶剂，壳聚糖为沉淀剂，在料液比1∶50、溶剂与沉淀剂比10∶1时提纯得到的茶皂素纯度为65.67%，回收率为94.36%。

2.4.2 沉淀茶皂素

使茶皂素沉淀的试剂主要有丙酮、乙醚、氧化钙、铅盐、胆甾醇等，其中丙酮是目前使用最广泛的。赵娟等[24]以茶皂素粗品为原料，对比了蒸馏水、80%甲醇、80%乙醇3种不同溶剂的效果，并比较了丙酮、乙酸乙酯、乙醚3种不同沉淀剂的效果，同时进行了工艺条件优化，结果表明当溶剂选用80%乙醇，沉淀剂选用丙酮，在料液比为1∶20、溶剂与沉淀剂比为1∶2时提纯效果最好，制备的茶皂素纯度可达87.20%，回收率达71.17%。

杨坤国等[25]将粗茶皂素先用索氏提取器抽提除杂并制得皂素-胆甾醇复合物(胆甾醇与皂素投料质量比0.75∶1)，选用甲苯作为溶剂再次用索氏提取器抽提分离该复合物，精制得到的茶皂素纯度达98.5%以上。

随着对沉淀法技术的研究，学者们尝试将两种沉淀剂联合使用。王金元等[26]以油茶籽水媒法提油后的水相为原料，先经过壳聚糖凝絮，再用氧化钙沉淀，最后通过碳酸氢铵释放来浓缩纯化，在较优的工艺条件下最终得到的茶皂素纯度为80.25%，此工艺有效解决了茶皂素水溶液浓缩问题，在茶皂素纯化方面有较好成效。

解庆范等[27]以乙醇浸提的茶皂素液为原料，用明矾沉淀法初提纯得到纯度为76.92%的茶皂素，再进行丙酮二次提纯，结果表明以80%乙醇为溶剂、丙酮为沉淀剂，在茶皂素粗品与溶剂比为1∶20、溶剂与沉淀剂比为1∶2时，提纯得到的茶皂素纯度可达93.6%。

2.5 吸附分离法

吸附是溶质从液相或气相转移到固相的过程。由于不同物质与吸附剂的吸附能力强弱不同，利用这一特性使目标物质和杂质分离，从而实现浓缩提纯目的的方法。这类方法操作简便、成本较低、过程安全，具有很大的应用前景。目前常用的吸附剂有活性炭、吸附树脂、凝胶吸附剂、硅胶吸附剂等。

2.5.1 活性炭吸附法

涂云飞等[28]采用活性炭柱层析纯化油茶皂苷，结果表明先用水洗再用90%乙醇进行洗脱能取得较好的分离效果，最终得率为62.9%，精制油茶皂苷纯度达50.1%以上。活性炭具有化学惰性、可再生性，是工业化纯化茶皂素的理想载体，但是目前活性炭吸附法纯化茶皂素存在产品得率不高，纯度欠佳的问题，限制了它的工业化应用。

2.5.2 吸附树脂分离法

吸附树脂由于吸附性能好、对有机成分选择性较高、成本低廉、易再生等特性，被广泛应用于液体中杂质的分离和纯化[29-31]。目前应用较多的是大孔吸附树脂，此种树脂在分离纯化茶皂素上表现出良好的效果。将粗茶皂素溶液通过大孔树脂后，先用水洗涤去除水溶性杂质如糖类物质等，然后再用梯度浓度的甲醇或乙醇依次洗脱。通过大孔树脂分离法精制的茶皂素产量大、纯度高，且该过程简单，成本低廉，可连续化操作，但是目前该技术在批量化生产上还不成熟。

金月庆等[32]以脱脂油茶饼粕80%乙醇浸提液为原料，用AB-8树脂进行纯化。在较优的条件下，茶皂素的吸附率达90.70%、总洗脱率达85.47%，最终得到的茶皂素产品纯度达85%。游瑞云等[33]也采用AB-8树脂进行茶皂素纯化，在最佳工艺条件下制备的茶皂素纯度达85.7%。

张海龙等[34]通过静态吸附和动态吸附筛选出合适的大孔树脂D4020型大孔树脂，并对洗脱剂体积、体积分数、洗脱流速等进行了工艺条件的优化，在优化的条件下进行吸附分离，得到的茶皂素纯度为81%，回收率达82%以上。

张云丰等[35]通过对比选用S-8型大孔树脂对含量为47.38%的茶皂素粗品进行纯化，并用响应面分析法优化茶皂素的洗脱条件，最终通过控制树脂柱量、粗茶皂素浓度及用量、上样流速、洗脱剂用量及流速等因素，实现茶皂素最大得率为81.74%，回收率为78.29%，含量为85.36%。

孙国金等[36]研究了D101型大孔树脂纯化茶皂素的工艺参数，除了对常规的上样浓度、流速及洗脱液浓度进行探讨外，还研究了一个新的影响因素：洗脱液与树脂体积比。当两者体积比5∶1时综合效果最好，最终洗脱率为83.6%，纯度可达92%。

魏婷婷等[37]在探究大孔树脂纯化茶皂素时发现DM130型树脂处理得到的茶皂素纯度最高，当上样液质量浓度为139.75 mg/mL、上样流速0.33 mL/min、洗脱液乙醇体积分数80%、洗脱流速3.57 mL/min时，制得的茶皂素纯度达85.6%。

顾姣等[38]通过对比8种不同极性的大孔树脂对茶皂素分离效果，发现XR910X效果最好。并提出两步洗脱，首先用NaOH溶液洗脱部分杂质，再用90%乙醇洗脱茶皂素，通过两步洗脱产品纯度得到进一步提高，最终在较优条件下制备的茶皂素纯度达94.26%，回收率也较高，为70.34%。

2.5.3 凝胶色谱法

凝胶色谱法是利用分子筛的原理来实现对不同相对分子质量化合物的分离，在用不同浓度的洗脱液洗脱时，各成分按相对分子质量从高到低的顺序依次被洗脱下来[39-40]。姜伟等[41]以油茶饼粕的乙醇提取液为原料，用Sephadex LH20进行分离纯化，得到的茶皂苷纯度可达到95.58%。凝胶色谱法操作简单，不需使用大量有机溶剂，对相对分子质量差异大的物质分离效果好，但是价格较昂贵，不适合工业应用。

2.5.4 硅胶吸附分离法

硅胶吸附分离是根据不同物质在硅胶上的吸附力存在差异的特性进行物质分离，一般情况下极性越大的物质越容易被硅胶吸附，反之亦然。其整个过程包括吸附、解吸、再吸附、再解吸。由于茶皂素极性较其他杂质大，依据此特性恰可采用硅胶吸附分离法进行提纯。

采用干法装柱，样品也采用干法上样，就绪之后用水饱和正丁醇溶液进行洗脱，收集茶皂素洗脱部分，再经过减压蒸馏至干，即得纯化茶皂素。干法装柱节约了时间成本和溶剂成本。而且由于干柱分离接近薄层层析，这样就更易于后续筛选合适的分离条件。硅胶吸附分离法虽然得到的茶皂素纯度较高，但此方法不适用于工业化生产[42]。

2.6 膜分离法

膜分离技术其实质近似于筛分过程，是根据滤膜孔径的大小使物质透过或被膜截留。常见的滤膜根据孔径大小分为4种：微滤膜，纳滤膜，超滤膜，反渗透膜。膜分离法纯化茶皂素具有分离效果好、耗能低、工艺简单、清洁无污染等优点，但同时存在膜通透量下降严重，生产成本高，不能大规模工业化生产等不足。

杜志欣等[43]先用0.3 μm微滤膜分离，透过液再用截留相对分子质量为5 000的超滤膜进行超滤，在0.16 MPa压力下超滤110 min，得到的茶皂素纯度为85.67%。孟维等[44]也采用微滤-超滤组合工艺对粗茶皂素水溶液进行精制，可将茶皂素纯度提高到91.8%左右，提升幅度高达20%以上。顾春雷等[45]先用孔径为0.5 μm的陶瓷膜预处理，再用PW超滤膜浓缩提纯，最终得到的茶皂素回收率为72%，纯度达到93%。

顾姣等[46]以乙醇水提法提取油茶籽油后剩余的水相副产物为原料，利用超滤膜法对茶皂素进行分离提纯，并优化超滤工艺条件：首先将水相稀释，降低茶皂素质量浓度至约13.13 mg/mL，调节pH至中性，然后通过10 kDa改良纤维素复合膜过滤，并在超滤后期加入3倍体积水稀释，最终茶皂素透过率可达64.39%，纯度达84.16%。

2.7 其他方法

除前文叙及的纯化方法外，还有一些其他方法如离子交换法，该法是利用待提纯溶液中各种离子与离子交换剂中的可交换基团的离子交换能力的强弱差异来进行分离的一种方法[47-48]。茶皂素粗品中含有的可溶性盐类可利用离子交换树脂去除，从而间接实现茶皂素提纯。阳离子交换树脂可选用磺酸型(732型)，阴离子交换树脂可选季铵盐型(717型)[42]。此方法得到的茶皂素纯度较高，但是处理量不大，一般需与其他方法配合使用。

3 结 语

茶皂素是我国优势植物资源，环境相容性好，广泛应用于建材、化工、生物医药及食品等行业。我国油茶资源丰富，政府扶持力度大，根据《全国油茶产业发展规划(2009—2020年)》，到2020年，我国油茶种植总规模将扩大到467万hm2，茶粕将达到约750万t，按油茶粕中茶皂素含量10%～22%计算，茶皂素产量最少可达75万t，相当可观，因此开发利用茶皂素具有重要的现实意义和前景。采取合理的纯化工艺纯化目前市场上的粗茶皂素，得到产量高、纯度好的高纯茶皂素，并可将纯化的茶皂素用于医药及化妆等精细化工行业，可更大地发挥茶皂素的价值潜能。