虹鳟鱼油的酶法提取工艺及其脂肪酸组成分析

赵保堂，牛 源，刘倩霞，刘 东，张 俊，张 继

(1.甘肃农业大学 食品科学与工程学院，兰州 730070； 2.甘肃特色植物有效成分制品工程技术研究中心，兰州 730070)

虹鳟鱼为淡水鱼，属冷水性鱼类，肉质细嫩，味道鲜爽，富含人体所需的氨基酸和微量元素，并含有化栓去血垢的碳烯酸，适合三高人群食用。在淡水鱼的加工过程中，可以利用的鱼体仅占40%～50%，而剩余50%～60%的鱼体(鱼头、鱼尾、鱼内脏等)则成为了副产物[1]。绝大多数虹鳟鱼加工副产物作为饲料或被直接丢弃，造成了资源的严重浪费与环境污染[2]。鱼类内脏中含有丰富的鱼油，鱼油中富含多不饱和脂肪酸，具有软化心脑血管、降低患动脉粥样硬化的作用[3-4]。随着人们认识的不断深入，鱼油相关产品越来越畅销，并进一步促进了人们对于鱼油提取以及精炼方法的研究。

目前，国内对鱼油的提取分析文献报道较多，但是对于虹鳟鱼油提取分析的研究几乎没有文献报道。对虹鳟鱼内脏中鱼油提取分析，可丰富鱼油的来源，提高鱼油产量，不但能得到高利用价值的产品，又能减轻环境污染[5-6]。迄今为止，已经报道的鱼油的提取方法有压榨法、稀碱水解法、索氏提取法和酶法等[5-7]。其中，索氏提取法与稀碱水解法为我国传统淡水鱼油提取的主要方法，该法虽然工艺条件比较成熟，但是在提取过程中产生的废液、废渣较多，且提取时间长，不能满足工业化大规模生产[8-11]。课题组成员前期采用超声波辅助溶剂法对虹鳟鱼油进行提取，结果表明，超声波辅助法提取鱼油虽然时间短、提取效率高，但需要对鱼油进行脱溶剂处理，工艺复杂[12]。而酶法条件温和、工艺路线简单、无溶剂残留，可同时提取油和蛋白质，生产过程中能耗相对较低而且适用于工业化生产, 具有广阔的市场前景。本研究通过对虹鳟鱼油的酶法提取工艺研究及其脂肪酸组成分析，旨在获得最佳的工艺条件，为后续的研究分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

虹鳟鱼内脏：购于兰州市永登县，去除胆囊及肠道内消化物，洗净沥干，并用绞肉机绞碎成糜状，冷藏备用。

木瓜蛋白酶(BR，800 U/mg)，上海禾午生物科技有限公司；胰蛋白酶(BR，250 U/mg)，上海谷研科技有限公司；胃蛋白酶(BR，3 000 U/mg)，湖南汇百侍生物科技有限公司。无水乙醇、甲醇、异辛烷，色谱纯；石油醚(沸程60～90℃)、乙醚、氢氧化钾、盐酸、硫酸氢钠、硫酸钠、三氯甲烷、冰乙酸、碘化钾、硫代硫酸钠，均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

FA1104N电子分析天平，上海民桥精密科学仪器有限公司；磁力搅拌器，上海森信实验仪器有限公司；循环水式真空泵，郑州长城科工贸有限公司；GC-MS 6800气相色谱-质谱联用仪，江苏天瑞仪器股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 虹鳟鱼内脏含油量的测定

准确称取虹鳟鱼内脏5.0 g，用滤纸包裹严实，置于索氏抽提器中，按照索氏提取法加入石油醚(沸程60～90℃)使包裹物完全浸没在石油醚中，水浴加热提取8 h，将提取后的液体用分液漏斗分离水分后，减压蒸发挥去石油醚，称量并计算虹鳟鱼内脏含油量。

1.2.2 虹鳟鱼油的酶法提取

准确称取虹鳟内脏5.0 g，置于50 mL锥形瓶中，加入蒸馏水，调节pH，加入酶，在一定温度下对其进行酶解一定时间，进行灭酶处理，经抽滤除去废渣后，用分液漏斗进行油水分离，分离出油层，加入无水硫酸钠除去水分，称鱼油质量，根据下式计算鱼油提取率。

提取率=提取得到的鱼油质量/虹鳟鱼内脏含鱼油质量×100%

1.2.3 酸价和过氧化值的测定

酸价参照GB 5009.229—2016测定，过氧化值参照GB 5009.227—2016测定。

1.2.4 脂肪酸组成的测定

1.2.4.1 脂肪酸甲酯的制备

脂肪酸甲酯参考张静等[13]的方法制备。

1.2.4.2 分析条件

GC条件：色谱柱为RTX-5MS 型弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样量为2.5 μL；程序升温为柱温160℃，保留2 min，然后以5℃/min 升至210℃，保留3 min，再以1℃/min升至220℃，保留1 min，最后以5℃/min 升至250℃，保留1 min。

MS条件：离子源为EI源，离子源温度250℃，传输线温度250℃。

1.2.5 统计分析

所有的实验都进行3次重复，所得数据取平均值。采用Design-Expert 8.0及Excel软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 酶种类对虹鳟鱼油提取率的影响

称取 5.0 g虹鳟鱼内脏，在液料比4∶1、加酶量2%、酶解时间60 min条件下，分别采用胃蛋白酶(酶解pH 2.0，酶解温度37℃)、木瓜蛋白酶(酶解pH 6.0，酶解温度65℃)、胰蛋白酶(酶解pH 8.0，酶解温度37℃)提取虹鳟鱼油，研究酶种类对鱼油提取率的影响，结果见图1。

图1 酶种类对虹鳟鱼油提取率的影响

由图1可知，采用的酶不同，提取率也有所不同，其中木瓜蛋白酶处理的鱼油提取率最高，达到了87.15%。不同蛋白酶的水解能力不同，主要是因为不同酶对肽键的专一性不同，木瓜蛋白酶的专一性最为广泛，能很好地水解肽键[5]。白鑫华等[14]在提取大鲵鱼油过程中，也发现木瓜蛋白酶专一性最为广泛，且很好地水解了肽键。因此，选取木瓜蛋白酶进行后续实验。

2.1.2 不同酶解时间对虹鳟鱼油提取率的影响

在酶解温度60℃、pH 6.5、加酶量2%，液料比4∶1的条件下，研究不同酶解时间(30、60、90、120、150 min)对鱼油提取率的影响，结果见图2。

图2 酶解时间对虹鳟鱼油提取率的影响

由图2可知，在酶解60 min内鱼油提取率快速增加，在酶解时间60 min时提取率达到82.30%。原因在于随着酶解时间的延长，酶与底物充分反应，破坏了脂肪和蛋白质的结构关系。随着酶解时间的继续延长，鱼油提取率变化不大。王倩倩等[8]在罗非鱼油的提取中，也证明酶与底物的反应会随着酶解时间的延长而使油脂释放得更加充分。因此，从能耗和提取率增加量等角度考虑，选取60 min为适宜的酶解时间。

2.1.3 不同液料比对虹鳟鱼油提取率的影响

在酶解时间60 min、酶解温度60℃、pH 6.5、加酶量2%的条件下，研究不同液料比(1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、6∶1)对虹鳟鱼油提取率的影响，结果见图3。

由图3可知，鱼油提取率在液料比为1∶2时最低，液料比为4∶1时提取率达到最大，为85.06%。继续增加液料比，提取率呈现下降趋势。因此，选取4∶1为适宜的液料比。

图3 液料比对虹鳟鱼油提取率的影响

2.1.4 不同酶解温度对虹鳟鱼油提取率的影响

在酶解时间60 min、pH 6.5、加酶量2%、液料比4∶1的条件下，研究不同酶解温度(40、50、60、70、80℃)对鱼油提取率的影响，结果见图4。

图4 酶解温度对虹鳟鱼油提取率的影响

由图4可知，酶解温度在40～50℃时，鱼油提取率显著增加。随着酶解温度的继续升高，鱼油提取率趋于上升。当酶解温度高于60℃时，鱼油提取率趋于下降，表明温度升高的同时，酶失活速度也上升。故选择60℃作为适宜的酶解温度。

2.1.5 不同加酶量对虹鳟鱼油提取率的影响

在酶解时间60 min、酶解温度60℃、pH 6.5、液料比4∶1的条件下，研究不同加酶量(1%、2%、3%、4%、5%)对鱼油提取率的影响，结果见图5。

图5 加酶量对虹鳟鱼油提取率的影响

由图5可知，随着加酶量的增多，鱼油提取率显著上升。加酶量为2%时，鱼油提取率达到最高。之后随着加酶量的继续增多，鱼油提取率缓慢降低。故选择2%为适宜加酶量。

2.1.6 不同pH对虹鳟鱼油提取率的影响

在酶解时间60 min、酶解温度60℃、加酶量2%、液料比4∶1的条件下，研究不同酶解pH(5.5、6.5、7.5、8.5、9.5)对鱼油提取率的影响，结果见图6。

图6 pH对虹鳟鱼油提取率的影响

由图6可知，酶解pH在5.5～6.5的范围内，随着pH的升高，鱼油提取率也随之升高，表明pH升高能促进蛋白水解，将油脂释放出来。pH为6.5时，鱼油提取率最高。随着pH的进一步提高，鱼油提取率趋于下降，反映出每种酶都有特定适应的pH范围。因此，选择pH 6.5为适宜酶解pH。

2.2 响应面实验

2.2.1 回归方程的建立及模型方差分析

在单因素实验结果的基础上，采用木瓜蛋白酶，固定液料比4∶1，以虹鳟鱼油提取率为目标函数Y，以酶解温度、酶解时间、pH、加酶量4个因素对应变量X1、X2、X3、X4，采用四因素三水平的响应面分析法优化酶法提取虹鳟鱼油的工艺条件，响应面实验因素与水平见表1,响应面实验设计与结果见表2。

表1 响应面实验因素与水平

运用Design-Expert 8.0软件，得到虹鳟鱼油提取率回归方程的方差分析如表3所示。

表2 响应面实验设计与结果

表3 方差分析

注：***p<0.000 1,差异极显著;**p<0.01，差异高度显著;*p<0.05，差异显著。

2.2.2 验证实验

将回归方程各自应变量取一阶偏导为0，得到的最佳酶解工艺条件为：酶解时间61.42 min，酶解温度61.52℃，pH 7.04，加酶量2.190%。考虑到实际操作的便利，将酶解参数修订为酶解时间61 min、酶解温度 61℃、pH 7.0、加酶量 2.2%。对优化后的工艺条件进行验证实验，重复5次，虹鳟鱼油平均提取率为88.67%。与课题组前期对虹鳟鱼内脏采用超声波辅助法(超声功率200 W、超声时间58 min、超声温度55℃、液料比为12∶1，虹鳟鱼油的最佳提取率为95.10%)相比，在相同的时间内，酶法的提取率较低，主要是因为在酶法提取过程中，由于较多虹鳟鱼内脏蛋白质溶出，导致形成稳定的乳状液，使鱼油提取率降低[12]。酶法提取得到的虹鳟鱼油呈浅黄色、稍有浑浊，具有鱼油腥味、无酸败味，酸价(KOH)和过氧化值分别为3.68 mg/g和1.75 mmol/kg，符合SC/T 3502—2016粗鱼油一级标准。

2.3 虹鳟鱼油的脂肪酸组成分析

对酶法提取的虹鳟鱼油进行脂肪酸组成分析，结果如表4所示。由表4可知，虹鳟鱼油主要由C14～C22脂肪酸组成，其中多不饱和脂肪酸中亚油酸相对含量最高，为26.75%，其次为亚麻酸，相对含量为8.93%，DHA相对含量为4.48%，EPA相对含量为0.97%。单不饱和脂肪酸油酸的相对含量为19.99%。与课题组前期对超声波辅助法提取的虹鳟鱼油的脂肪酸组成(油酸20.09%，亚油酸26.42%，亚麻酸9.24%，EPA 1.12%，DHA 4.45%)相比，两者从组成到含量均无明显差异，但酶法提取具有无溶剂残留、工艺路线简单，可同时提取油和蛋白质等优点[12]。

表4 虹鳟鱼油主要脂肪酸组成

3 结 论

本文以虹鳟鱼内脏为原料，以虹鳟鱼油提取率为指标，在单因素实验的基础上，经过响应面法优化确定酶法提取虹鳟鱼油的最佳工艺条件为：采用木瓜蛋白酶，液料比4∶1，酶解时间 61 min，酶解温度61℃，酶解pH 7.0，加酶量2.2%。在最佳工艺条件下，虹鳟鱼油提取率达88.67%。提取得到的虹鳟鱼油呈浅黄色、稍有浑浊，具有鱼油腥味、无酸败味，酸价(KOH)和过氧化值分别为3.68 mg/g和1.75 mmol/kg，符合SC/T 3502—2016粗鱼油一级标准。同时GC-MS分析显示，酶法提取的虹鳟鱼油主要不饱和脂肪酸组成为油酸19.99%、亚油酸26.75%、亚麻酸 8.93%、DHA 4.48%、EPA 0.97%。在后续工作中，将继续优化酶解条件以提高虹鳟鱼油提取率，同时回收水相中蛋白质，从而推动酶法提油在虹鳟鱼油中的工业化应用。