正交实验法优化白花蛇舌草中三萜类成分的提取工艺

陈丽娜，刘春明，杨晓静

(长春师范大学中心实验室，吉林长春 130032)

白花蛇舌草(Hedyotisdiffusa)，系茜草科耳草属植物[1]。别名蛇舌草、蛇利草、蛇总管、鹤舌草、龙舌草等。常以全草供药用，具有清热解毒、消痈、利湿通淋的功效，常用于治疗各种肿瘤及炎症[2]。药理研究发现白花蛇舌草中三萜类化合物作为其中的活性成分之一，具有抗肿瘤、抗菌、护肝、免疫调节等方面的活性[3]。关于白花蛇舌草中三萜类化合物的提取工艺的研究尤为重要。谢艳、丁博等[4-5]采用溶剂回流提取法粗提并结合有机溶剂萃取，初步提取并测定了白花蛇舌草中的三萜类化合物的含量，该方法提取时间长，溶剂耗费多且在萃取时涉及有毒的有机溶剂。陆慧等[6]通过正交试验对白花蛇舌草中的三萜类化合物的超临界CO2萃取工艺进行优化，萃取率虽然较前者有所提高，但耗费时间长。张才华等[7]利用索氏提取方法提取了白花蛇舌草中两种三萜类成分——齐墩果酸和熊果酸，该方法以氯仿为溶剂，耗费8 h，同样存在耗时长、有机溶剂使用量大的问题。

1995年，Richter等[8]提出了一种全新的萃取方法——加速溶剂萃取法(Accelerated Solvent Extraction, ASE)。该方法是通过提高温度和增加压力来进行有机溶剂的自动萃取，具有有机溶剂用量少、萃取快速、样品回收率高等突出优点，被美国环保局(EPA)推荐为标准方法[9]。

本文首次引入加速溶剂萃取法(ASE)提取白花蛇舌草中的三萜类化合物，通过正交试验并结合简单可行的紫外分光光度法定量，最终得到加速溶剂提取的最佳提取工艺。在提高提取率的基础上，节省了大量的溶剂和时间，通过重复试验进一步验证了此方法的稳定性和可行性。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

加速溶剂萃取装置(戴安中国有限公司，ASE-150)；旋转蒸发仪(德国，Heidolph)；紫外分光光度计(日本岛津有限公司，UV-2450)。

1.2 试剂

白花蛇舌草(河北保定同仁堂，长春师范大学中心实验室王晶鉴定)；齐墩果酸标准品(纯度≥98.5%,购自aladin)；无水乙醇(分析纯，购自北京化工厂：配置成不同体积分数待用)；甲醇(色谱级，美国Thermo Fisher公司)；实验用水为超纯水(LaboStarTMTWT UV7，美国SIEMENS公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 总三萜的测定

以齐墩果酸为标准品，利用紫外分光光度法测定总三萜含量，测定波长为203 nm。

1.3.2 对照品溶液的制备

精密称取齐墩果酸对照品10.0 mg置于10 mL容量瓶中，加入80%甲醇溶解后，用甲醇定容至刻度，摇匀，既得(每毫升含齐墩果酸对照品1.0 mg)。

1.3.3 供试品溶液的制备

精密称取白花蛇舌草粉末2.0 g置于ASE提取釜中，以ASE法进行提取。提取溶剂为90%的乙醇，提取温度为80℃，提取时间为10 min，提取次数为3次。合并提取液，减压浓缩至干，用4 mL甲醇溶解，稀释1000倍，待测。

1.3.4 方法学研究

取上述齐墩果酸对照品溶液，用甲醇逐级稀释，制备齐墩果酸质量浓度分别为0.004、0.008、0.010、0.015、0.020、0.030、0.040 mg·mL-1的标准品溶液。取浓度为0.030 mg·mL-1的标准品溶液在200～400 nm范围内进行扫描，确定齐墩果酸的最大吸收波长为203 nm。在最大吸收波长处分别测定上述标准品的吸光度，以质量浓度X(mg·mL-1)为横坐标，吸光度Y为纵坐标进行回归分析，制备齐墩果酸的标准曲线。取浓度为0.020 mg·mL-1的齐墩果酸标准品溶液连续3次测定吸光度值，考察方法的精密度。分别准确称取同一批次白花蛇舌草药材粉末3份，按1.3.3方法制备并测定其总三萜含量，考察方法的重复性。取同一供试品溶液，在一天内，每隔4 h测定一次吸光度值，考察方法的稳定性。

1.3.5 提取工艺研究

选择乙醇体积分数(A)、提取温度(B)、提取时间(C)及提取次数(D)这4个因素为考察因素，每个因素选择3个水平，以L9(34)正交设计表安排实验，以总三萜的含量为评价指标。因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.3.6 总三萜含量的计算

按照公式(1)对白花蛇舌草提取物中总三萜含量进行测定。

(1)

其中，A为供试品溶液的吸光度；本实验稀释倍数为4000倍；粗粉质量均为2.0 g。

2 结果与讨论

2.1 总三萜含量的测定

齐墩果酸的标准曲线见图1，相关系数R为0.9982，表明线性关系良好。精密度实验的相对标准偏差RSD为0.16%(n=3)，表明仪器精密度良好。重复性实验的相对标准偏差RSD为0.98%(n=3)，表明方法的重现性良好。稳定性实验的RSD为0.36%(n=6)，表明供试品溶液中总三萜的含量在24 h内基本稳定。

图1 齐墩果酸的标准曲线

2.2 提取工艺研究

分别精密称取白花蛇舌草粉末2.0 g，按正交表的设计进行实验，用紫外分光光度法测定三萜类化合物的含量，并进行方差分析，结果见表2和表3。

表2 L9(34)正交试验结果分析表

表3 正交试验方差分析表

方差分析结果表明，应用加速溶剂萃取法提取三萜类化合物时，提取效率的影响因素大小顺序依次为：提取温度>提取时间>乙醇体积分数>提取次数。由正交实验表可以看出，最佳提取工艺组合为A2B2C3D1，即提取温度为80℃，提取时间为15 min，乙醇体积分数为90%，提取次数为1次。

2.3 总三萜的提取率

根据2.2所确定的最佳提取工艺，对白花蛇舌草中总三萜进行提取，按公式(1)进行计算。2.0 g白花蛇舌草中三萜类化合物的提取量为112.77 mg·g-1，提取率为11.3%。

3 结论

本文通过正交试验研究了乙醇体积分数、提取温度、提取时间、提取次数对加速溶剂萃取法提取白花蛇舌草中三萜类化合物提取率的影响。结果表明，各因素的影响顺序依次为：提取温度>提取时间>乙醇体积分数>提取次数，最佳提取工艺组合为：提取温度为80℃，提取时间为15 min，乙醇体积分数为90%，提取次数为1次。在此条件下，白花蛇舌草中三萜类化合物的提取率达11.3%(w/w)。加速溶剂萃取—紫外分光光度法联用技术可以用于快速分析白花蛇舌草中总三萜类化合物含量。与其它提取方法相比，此方法提取率高，操作简便快捷,节省溶剂且稳定性好，是应用前景较好的提取方法之一。