鸡马立克氏病与白血病混合感染的实验室诊断

俞远荣，汪德生

(1.贵州省榕江县农业局，贵州 榕江 557200；2.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025)

鸡马立克氏病(Marek’s disease，MD)是鸡的一种淋巴组织增生性疾病，以外周神经、性腺、虹膜、各内脏器官、肌肉和皮肤等单个或多个组织器官发生单核细胞浸润为特征。本病是由细胞结合性疱疹病毒引起的传染性肿瘤病，病鸡常见消瘦、肢体麻痹，并常有急性死亡[1]。鸡白血病(Avian leukosis)是由禽白血病肉瘤病毒群中的病毒引起鸡的多种肿瘤性疾病的统称，临床上有多种表现形式，主要是淋巴白血病，其次是成红细胞白血病、成髓细胞白血病、骨髓细胞病、肾母细胞瘤、骨石病、血管瘤、肉瘤和皮瘤等[2]。2018年3月，某养鸡场出现病鸡缩头闭眼、离群呆立、流泪、腹泻、消瘦、鸡冠小而苍白为特征的病例，通过流行病学调查、病理剖检及实验室诊断，确诊为马立克氏病与禽白血病混合感染。现将诊断情况报道如下。

1 发病情况

2018年1月10—17日，该鸡殖场引进30日龄小香鸡脱温苗8 600羽进行放养，3月11日部分鸡出现缩头闭眼、离群呆立、流泪、腹泻等症状，鸡体消瘦，鸡冠小而苍白，随后出现死亡，用抗生素治疗无效。至5月14日全群发病，发病率高达 100%，已死亡4 600只，死亡率为53.49%(4 600/8 600)。

2 病理变化

解剖病死鸡发现:部分肝脏肿大，有白色坏死点；心包腔积液，表面有坏死结节；脾脏肿大；腺胃肿大，乳头与乳头之间发生融合；十二指肠肠壁增厚，有出血；扁桃体肿大、出血；肾脏肿大。

3 实验室检测

3.1 细菌分离培养与染色镜检取病死鸡肝脏直接触片，染色镜检，未观察到细菌。同时将病料接种在鲜血琼脂培养基上，37℃培养24 h观察，未见菌落生长。

3.2 马立克氏病抗原检测采集病死鸡羽髓经常规处理，与标准马立克氏病阳性血清(抗体)进行琼脂扩散实验，结果检测抗原与标准阳性血清产生白色沉淀线，表明在羽髓中存在马立克氏病病毒(抗原)。见图1。

图1 马立克氏病羽髓病毒抗原检测

3.3 马立克氏病抗体检测采集送检病鸡血液，以3 500 r/min离心10 min，分离血清，与标准马立克氏病阳性抗原进行琼脂扩散实验，结果检测血清与标准抗原产生白色沉淀线，表明在血液中存在马立克氏病抗体。见图2。

图2 马立克氏病血清抗体检测

3.4 相关病毒核酸检测

3.4.1新城疫病毒核酸检测:取送检病死鸡的肝脏和脾脏，分别加入适量DEPC溶液充分研磨后，提取其RNA。通过实时荧光RT-PCR检测，未检出新城疫病毒核酸。

3.4.2禽白血病病毒核酸检测:核酸提取方法同新城疫。(1)反转录:用康为世纪公司生产的HiFi-Script cDNA第一链合成试剂盒。反应体系(总体积20 μL):Dntp Mix 2.5 mmol/L Each 4 μL，Primer Mix 2 μL，RNA Template 2 μL，Buffer 4 μL，DTT 2 μL，HiFiScript 1 μL，Water 5 μL。 充分混匀后，42 ℃ 孵育30～50 min，85℃孵育5 min。 1 000 r/min离心30 s，-20℃冷却。(2)PCR扩增:取反转录所得样品进行PCR扩增，上游引物(P1)和下游引物(P2)由上海捷瑞生物工程有限公司合成，2×EsTaqMasterMix购自康为世纪公司。反应体系(总体积25 μL):EsTaqMix 12.5 μL，模板 DNA 2 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，ddH2O 8.5 μL。 阴性对照用无酶水代替模板cDNA。(3)做好标记后在PCR扩增仪上进行以下程序:95℃ 4 min；94℃30 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共循环 33 次；再72℃延伸10 min。(4)电泳:在电泳槽内放好梳子，倒入溶解的琼脂凝胶。待凝固后取出梳子，在琼脂糖凝胶孔中加入2 000 bp DNA Marker(购自TaKa-Ra公司)5 μL和 PCR扩增产物8 μL。以100 V电压电泳，30 min后用凝胶成像仪观察结果。由图3可见，检测样品在921 bp处出现特异性条带，判定禽白血病病毒核酸检测结果为阳性。

图3 禽白血病病毒PCR扩增结果

3.4.3马立克氏病病毒核酸检测:核酸提取方法同新城疫。(1)取反转录所得样品进行PCR扩增:上游引物(MD1)和下游引物(MD2)由上海捷瑞生物工程有限公司合成，2×EsTaqMasterMix购自康为世纪公司。(2)反应体系(总体积25 μL):EsTaqMix 12.5 μL，模板 DNA 2 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 8.5 μL。 阴性对照用无酶水代替模板DNA。(3)做好标记后在PCR扩增仪上进行以下程序:95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 1 min，72 ℃1 min，共循环33次；再72℃延伸10 min。(4)电泳:在电泳槽内放好梳子，倒入溶解的琼脂凝胶。待凝固后取出梳子，在琼脂糖凝胶孔中加入2 000 bp DNA Marker(购自TaKaRa公司)5 μL和PCR扩增产物8 μL，以100 V电压电泳，30 min后用凝胶成像仪观察结果。结果判定:阴性对照无条带出现(引物带除外)时，实验结果成立；被检样品出现809 bp扩增带为禽白血病病毒阳性，否则为阴性。由图4可见，检测样品在809 bp处出现特异性条带，判定马立克氏病病毒核酸检测结果为阳性。

图4 马立克氏病病毒PCR扩增结果

4 结果与讨论

4.1根据流行病学、病理变化、实验室检测结果，确诊送检病鸡为马立克氏病和禽白血病混合感染。

4.2马立克氏病、禽白血病都属于免疫抑制疾病，主要侵害免疫器官，如肝脏、脾脏、法氏囊等，目前对该类疫病无特效药物进行治疗，一旦感染其中的任何1种疫病，只能淘汰处理。

4.3针对以上2种疫病的预防主要采取以下方法:(1)种禽场在雏鸡出壳的24 h内接种马立克氏病疫苗，且在接种后的7日龄内严格环境消毒，防止鸡体未产生抗体就感染野毒。(2)禽白血病目前尚无疫苗进行预防，种禽场主要采取净化方法。