液相色谱-串联质谱测定食醋中生物胺含量

魏泉增，汤 雅，李伟民

（1.许昌学院 食品与生物工程学院，河南 许昌 461000；2.河南省食品安全生物标识快检技术重点实验室，河南 许昌 461000）

食醋是我国重要的调味品，有两千多年的悠久历史。酿造的地理环境、原料与工艺的差异，生产出具有不同风味的食醋。酿造食醋的原料有大米、小麦、高粱、小米、麸皮、含糖分的果类等[1]。在微生物氨基酸脱羧酶作用下将氨基酸脱羧生成生物胺，通过氨基化和转胺作用也能使醛和酮转化为生物胺[2]。适量生物胺可促进人体的正常生理活动，但生物胺的浓度超过一定的限度会对人体产生严重的危害[3-4]，损伤人体的神经系统和心血管系统。因此，建立快速简便地检测食醋中生物胺含量的方法，对保证食醋食用安全具有重要意义。

由于生物胺分子中缺少发色基团，无紫外吸收、也无荧光及电化学活性，因此，分离及测定各类生物胺的含量存在一定的困难。目前，检测生物胺的方法主要为衍生化-高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）[5-7]法。也有用生物传感器法[8]、毛细管电泳法[9]、薄层色谱法[10]等测定食品中生物胺。唐晗等[11]利用化学发光传感器检测食品中生物胺含量。刘方震[12]利用毛细管电泳技术检测尿样、酱油等样品中的生物胺，分离速度快、效能高并且消耗样品量极少，但选择性差。李燕君[13]改良了传统的薄层色谱检测方法并成功定性、定量检测黄酒中生物胺的含量。黄祖新[14]采用高效液相色谱法检测了福建红曲醋中各生物胺含量。瞿凤梅等[15]采用丹磺酰氯衍生化结合HPLC的方法检测泡菜中的生物胺含量。HPLC方法是常用的检测方法，但需要进行柱前或柱后衍生，具有反应条件苛刻、衍生产物不稳定及前处理耗时较长等不足。本研究采用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法测定食醋中多种生物胺的含量，为食醋企业提供可靠数据，以期控制食醋生产过程中生物胺的产生，保证食醋的安全。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

食醋样品均购买于许昌市时代广场，样品1，老陈醋（山西）；样品2，黑米醋（广东）；样品3，老陈醋（山西）；样品4，老陈醋（江苏）；样品5，香醋（上海）；样品6，老陈醋（山西）；样品7，香醋（江苏）；样品8，香醋（江苏）。

精胺、亚精胺、酪胺、组胺二盐酸盐、腐胺、尸胺、色胺：阿拉丁公司；甲酸、乙腈（均为色谱纯）：美国西格玛公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 6460型串联三重四极杆质谱仪、Agilent 1290型液相色谱仪：美国安捷伦公司；Mili-Q型超纯水仪：密理博公司；ME104T/02电子天平：梅特勒-托利多集团。

1.3 方法

1.3.1 生物胺标准系列溶液的配制

7种生物胺标准储备溶液制备：分别称取色胺3.4 mg、酪胺2.6mg、组胺二盐酸盐3.4mg、精胺5.1mg、亚精胺4.6mg、腐胺1.8 mg、尸胺1.7 mg于10 mL的容量瓶中，定容，配成340 mg/L（色胺）、260 mg/L（酪胺）、205 mg/L（组胺）、510 mg/L（精胺）、460 mg/L（亚精胺）、180 mg/L（腐胺）、170 mg/L（尸胺）标准储备溶液。使用超纯水将混合标准溶液按1∶2的稀释度稀释成系列浓度标准溶液。

1.3.2 样品的前处理

准确量取1mL各品牌的食醋样品，超纯水定容至10mL，0.45 μm滤膜过滤，直接进样分析。

1.3.3 色谱条件与质谱条件

色谱条件：Agilent XDB-C3（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，柱温30℃，进样量5μL，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%的甲酸乙腈溶液；0～5 min时，5%～20%的B溶液；流速为0.3mL/min。

质谱条件：电喷雾离子源（electrosprayionization，ESI），正离子扫描；干燥气为氮气（N2），干燥气温度为300℃，干燥气流量为8 L/min；雾化气压力为30 psi，鞘气温度为300℃，鞘气流量为11 L/min；毛细管电压为4000 V（正离子模式）；锥孔电压为500V（正离子模式）；检测方式为多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）。

取生物胺标准品，进行子离子优化。母离子为M+1，毛细管出口电压50～150 V，步长为5 V，碰撞能量5～50 V，步长为4 V，加速电压为4 V。

1.3.4 数据处理

定性分析：在相同的色谱和质谱条件下，对照7种生物胺标准品定性离子，以及出峰时间，对样品中各生物胺进行定性分析。

定量分析：通过不同生物胺定量离子的峰面积，根据7种生物胺标准曲线的回归方程，计算食醋样品中各生物胺的含量。

试验结果采用Minitable（17.0版）计算平均值与相关性分析[16]。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的选择结果

生物胺是一类具有生物活性的小分子碱类化合物，极性较大，因此，实验中选用C3柱，以此实现7种生物胺的分离和检测。优化后的子离子见表1，加速电压为4V。其中，丰度最大为定量离子，丰度次大为定性离子。5min内7种生物胺全部岀峰（见图1）。生物胺色谱出峰顺序为亚精胺、腐胺、尸胺、组胺、精胺、酪胺、色胺，出峰时间分别为0.959min、0.996 min、1.004 min、1.012 min、1.098 min、1.892 min、4.064 min。

图17 种生物胺dMRM色谱图Fig.1 Chromatogram of dMRM for 7 kinds of biogenic amines

2.2 标准曲线回归方程、检出限和定量限

按照各标准品峰面积（y）对相应的标准溶液质量浓度（x）作标准曲线，得到标准曲线的回归方程及相关系数。以信噪比（S/N）=3作为检出限，信噪比（S/N）=10作为定量限，7种生物胺的最低检出限见表2。各生物胺线性回归方程在0.50～20 mg/L范围内，线性相关系数R2均≥0.990，符合测定的要求。结果表明，该方法对生物胺灵敏度高，可以满足样品测定的要求。

表2 生物胺标准曲线的回归方程、相关系数、线性范围及检出限Table 2 Regression equations of the standard curve,correlation coefficients,linearity range and limits of detection of biogenic amines

2.3 方法的回收率

方法的回收率试验结果见表3。从表3可看出，7种生物胺的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在0.31%～3.29%，表明具有良好的重复性，7种生物胺的回收率也均在91.1%～102.17%。可见该方法回收率高，可用于检测食醋中生物胺的含量。

表3 生物胺的加标回收率结果Table 3 Results of recovery rate of biogenic amines

2.4 8种食醋样品中生物胺的测定

不同品牌食醋中的生物胺含量见表4。

表4 食醋中的生物胺含量Table 4 Contents of biogenic amines in vinegar samples mg/L

生物胺的种类和含量因食醋的品种和制作方法的不同而有所差别，由表4可知，本研究的每一个样品中至少含有4种生物胺，所有样品中均未检出色胺，表明在酸性条件不利于色胺的形成。少部分食醋样品中未检出组胺和酪胺。

食醋中不同生物胺的含量见图2。由图2可知，8种样品中亚精胺的平均含量高于其他生物胺的平均含量，除色胺外，组胺的平均含量最低。精胺、亚精胺、腐胺和尸胺是食醋中主要的生物胺，所有样品中都能检出上述4种生物胺，组胺、酪胺和色胺的检出率分别为75%、87.5%和0%。已知7种生物胺毒性最强的是组胺[17]，而食醋中组胺的含量并不高，表明食醋的低pH抑制了组胺的形成。

图2 食醋中不同生物胺含量Fig.2 Contents of different biogenic amines in vinegar samples

不同种类食醋样品中生物胺含量测定结果见图3。由图3可知，陈醋、米醋和香醋3类食醋样品中6种生物胺的含量有明显差别。香醋中6种生物胺含量均高于陈醋和米醋，陈醋次之，米醋各生物胺含量最低。3类食醋中总生物胺含量的变化也较大，其中陈醋中总生物胺含量为77.58 mg/L，米醋总生物胺含量为13.48 mg/L，香醋的总生物胺含量为150.87 mg/L，这可能是与3类食醋的生产工艺和微生物种类不同有关。

图3 不同种类食醋样品中生物胺含量Fig.3 Contents of biogenic amines in different kinds of vinegar samples

2.5 样品中生物胺含量的相关性分析

为寻找生物胺相互之间的关系，采用Minitable软件对食醋中不同种类生物胺含量之间的相关性进行分析，结果见表5。由表5可知，组胺除了与酪胺显著相关外（P＜0.01），与其他5种生物胺之间均没有显著相关性（P＞0.01）；腐胺与尸胺之间具有显著相关性（P＜0.01），与其他5种生物胺也均没有显著相关性（P＞0.01）。其他生物胺之间没有显著的相关性（P＞0.01）。原因可能是不同酿造工艺中产生的游离氨基酸含量不同，各底物浓度之间没有相关性；产脱羧酶具有多种底物[18-19]，如一些乳杆菌（Lactobacilli）发酵可生成组胺、酪胺，这就造成了酪胺和组胺具有一定的相关性，而肠杆菌科（Enterobacteriaceae）微生物则有同时生成腐胺和尸胺的能力[20]。一些外界因素也会影响组胺的形成，此外，温度也会影响生成生物胺各个不同的组分，如合成组氨酸脱羧酶的最适温度为30℃，产生组胺的嗜温细菌生存所需要的温度须高于14℃，低温冷藏不利于组胺的形成。

表5 生物胺各组分之间的相关性Table 5 Correlation between components of the biogenic amines mg/L

3 结论

采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定8种食醋品牌中7种生物胺含量，所有样品中均检出精胺、亚精胺、腐胺和尸胺，酪胺和组胺存在于大多数食醋中，部分样品中未检出，此外，食醋样品中均未检出色胺。结果表明，食醋中所含生物胺的种类及含量因食醋的品种而异，除色胺外，其他6种生物胺总量的范围为47.88～244.58mg/L，亚精胺，腐胺和酪胺的含量较高。组胺与酪胺，腐胺与尸胺含量具有显著的相关性。