氯霉素单克隆抗体制备以及化学发光检测试剂盒的研制

吴小胜，焦 强，万宇平，王兆芹，王琳琛，丛倩千，朱亮亮，何方洋

（1.北京勤邦生物技术有限公司，北京 102206；2.河南省口岸食品检验检测所，河南 郑州 450003；3.北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心，北京 102206）

氯霉素（chloramphenicol，CAP）是一种广谱抗生素，价格低廉，应用效果较好，对细菌有很好的抑制作用，曾经在渔、牧业中应用广泛。由此导致相应的动物源性食品受到了氯霉素污染，通过食物链被人体摄入，可能引发多种疾病[1-5]。

国际食品学界将氯霉素列为禁药，欧盟、美国等均规定了氯霉素残留限量标准为不得检出。欧盟“2002/657/EC”标准规定，氯霉素在动物源性食物中的最大检出限是0.3 μg/kg[6]。我国农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》规定了氯霉素在所有食品动物的可食用组织中不得检出，并将其从《中国兽药典》中删除，列为禁药。我国规定氯霉素不得检出，目前，检测氯霉素的方法有物理化学法和免疫化学法等[7-10]，前者包括高效液相色谱法[11-13]、质谱法[14-16]等，后者主要为酶联免疫法[17]。化学发光免疫法[18]具有检测速度快、自动化程度高、特异性好、稳定可靠等优势[19-20]。与酶联免疫法和理化检测方法相比，检测限高几个数量级。化学发光检测方法具有明显的成本优势，更加适宜于基层实验室的大批量样本检测。因此，本研究通过制备出检测鱼肉和虾肉中氯霉素的化学发光检测试剂盒，为基层实验室提供选择。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯霉素标准品：北京标准物质研究中心；甲醇、钯炭催化剂、二甲基甲酰胺、氯甲酸异丁酯、尿素、淀粉碘化钾试纸、卵清蛋白、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、鲁米诺：北京百欣试剂公司；10kg草鱼肉和10 kg对虾肉：城北批发市场；发光底物液、复溶工作液、小鼠脾细胞：北京勤邦生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

HMC-D2全自动化学发光免疫分析仪：北京勤邦生物技术有限公司；MX-F涡旋仪：湖南湘立科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗原制备

（1）半抗原的制备

将30 mg氯霉素溶于甲醇中，加入5%的钯炭催化剂（Pd/C），通入氢气，保持一定压力，室温反应2 h，过滤（5 mL针筒中加棉花和滤纸，压滤）除去Pd/C，蒸干溶剂得到淡黄色黏稠液体，既得氯霉素半抗原。Pd/C与氯霉素的摩尔比为1∶10。将上述得到的目标物在0～5℃条件下，用1 mol/L盐酸调pH值为1～2，搅拌下滴加0.1～1 mol/L的NaNO2溶液，使淀粉碘化钾试纸变蓝，再滴加0.1～1 mol/L尿素溶液，使淀粉碘化钾试纸变浅蓝，再加0.1～1 mol/L的NaOH溶液调pH值为7～9，得到清液作为溶液A备用。

称取71.5 mg牛血清白蛋白（BSA）溶于5mL0.1mol/L的碳酸盐缓冲液中，4℃预冷。用1mol/LNaOH调BSA的pH至8。将配制好的溶液A液迅速加入BSA中，4℃搅拌反应4 h。氯霉素半抗原的合成路线见图1。

图1 氯霉素半抗原合成路线Fig.1 Synthesis route of chloramphenicol hapten

（2）免疫原的制备

取氯霉素半抗原30 mg，用1.5 mL水溶解，得到（I）液；取50%的戊二醛（glutaraldehyde，GA）水溶液10 μL加入（I）中，室温下搅拌反应18 h，得到（II）液；用1.5 mL水稀释100 mg BSA，将其加至（II）液中；反应过夜，再加入24 mg NaBH4，反应3 h；最后用三蒸水透析48 h，即得免疫原。

1.3.2 单克隆抗体制备

将1.3.1得到的氯霉素免疫原免疫小鼠，制备氯霉素单克隆抗体[21]。

1.3.3 试剂盒检测方法

配制质量浓度依次为0、0.025 μg/L、0.1 μg/L、0.4 μg/L、1.6μg/L、6.4μg/L的氯霉素标准品，用全自动化学发光免疫分析仪绘制标准曲线，计算检测结果。

1.3.4 鱼肉和虾肉样本的前处理方法

用均质器均质样本；称取3.0±0.05g均质后的样本，加入6 mL乙酸乙酯，涡旋3 min，混匀；3 000×g，室温（20～25℃）离心5 min；取2 mL乙酸乙酯相至8 mL玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1 mL正己烷，涡旋30 s，再加入1 mL复溶液，涡旋1 min，混匀，3 000×g，室温（20～25 ℃）离心5 min；除去上层有机相，取下层水相用于分析。

1.3.5 检测性能

（1）检测限

测定20份鱼肉和虾肉空白样本，利用空白样本浓度的平均值加上3倍标准差，计算检测限（limit of detection，LOD）[22]。

（2）精密度和准确度

我国农业部发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》规定了氯霉素在动物性食品中禁止检出。参考《农残办技术材料要求及审查程序》规定，即对于禁用药物，添加浓度至少为1倍定量限和2倍定量限。因此，本研究分别对鱼肉样本添加氯霉素，使其质量浓度达到0.05 μg/kg、0.1 μg/kg和0.2μg/kg，测定回收率，用来评价准确度。另外，每个样本做4个平行，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），用来评价精密度。

（3）稳定性测定

将试剂盒放置于4℃保存，每月测定一次鱼肉样本的回收率和半抑制浓度（halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50），连续测定12个月。

（4）抗体特异性测定

选择氯霉素的结构类似物：棕榈氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考胺，检测氯霉素及其类似物的IC50，根据交叉反应率公式计算该试剂盒对于棕榈氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考胺的交叉反应率，计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 半抗原鉴定

利用核磁共振氢谱法测定1.3.1制备的半抗原，化学位移δ=6.27 ppm的吸收峰为氯霉素硝基还原成氨基的氢吸收峰，如图2所示，该信号的出现说明半抗原合成成功。由于各个核磁仪器的场强不同，对同一样品测出的“绝对”频率位移也会不一样。

图2 氯霉素半抗原核磁共振氢谱Fig.2 1H NMR of chloramphenicol hapten

2.2 标准曲线

配制质量浓度依次为0、0.025μg/L、0.10μg/L、0.40μg/L、1.6μg/L、6.4μg/L的氯霉素标准品，利用全自动化学发光免疫分析仪测定空白溶液吸光度值B0及各样品吸光度值B，结果见图3。

图3 氯霉素标准曲线Fig.3 Standard curve of chloramphenicol

由图3可知，标准曲线的线性范围为0～6.4 μg/L，经回归拟合得到标准曲线方程为y=-1.9518x-1.4909，R2=0.9985，IC50为0.187 μg/L，检测灵敏度为0.025 μg/kg。

2.3 检测限

通过测定20个鱼肉空白样本中氯霉素质量浓度，根据1.3.5计算检测限，结果见表1～2。

表1 鱼肉空白样本检测限测定结果Table 1 Detection limit results of blank sample of fish μg/kg

表2 虾肉空白样本检测限测定结果Table 2 Detection limit results of blank sample of shrimp μg/kg

由表1～表2可知，测定20个鱼肉样本中氯霉素平均值为0.018μg/kg，标准偏差为0.010μg/kg，检测限为0.047μg/kg；测定20个虾肉样本中氯霉素平均值为0.019 μg/kg，标准偏差为0.009 μg/kg，检测限为0.045 μg/kg。

2.4 精密度

根据1.3.5，测定添加0.05 μg/kg、0.1 μg/kg和0.2 μg/kg质量浓度的氯霉素鱼肉样本，用来评价精密度和准确度，试验结果见表3。

表3 鱼肉加标回收率及精密度试验Table 3 Standard recovery and precision tests of fish sample

由表3可知，用试剂盒检测鱼肉中氯霉素的回收范围在83.5%～109.3%之间，批内相对标准偏差范围是5.0%～9.3%；批间相对标准偏差范围是7.0%～7.5%。批内批间相对标准偏差均＜10%，说明试剂盒准确度及精密度较好。

2.5 稳定性

4℃下储存试剂盒，每月检测一次IC50和回收率，用来评价试剂盒稳定性，结果见表4。

表4 试剂盒在4℃保存的稳定性Table 4 Stability of the kit kept at 4℃

由表4可知，测定无添加氯霉素试剂盒的IC50范围是0.123～0.243 μg/L，回收率范围在83.7%～106.6%之间，两项指标均在正常范围之内。4℃条件下试剂盒能够保存12个月。

2.6 抗体特异性的测定

氯霉素抗体与棕榈氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考胺的交叉反应率见表5。

表5 交叉反应率试验Table 5 Cross reaction rate tests

由表5可知，氯霉素抗体与棕榈氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考胺的交叉反应率均＜1%，说明氯霉素抗体特异性较好。

2.7 讨论

通过酶联免疫方法检测氯霉素居多，而化学发光检测方法应用于快速检测行业尚不成熟，因此，本研究具有一定的研究价值。陈霞等[9]研究发现，高灵敏度酶联免疫法对动物源性产品中氯霉素的检测限在0.1 μg/kg以下，没有本研究的试剂盒灵敏。

3 结论

本研究通过制备抗氯霉素单克隆抗体，研发出检测水产品中氯霉素的化学发光试剂盒，试剂盒的标准曲线范围为0～6.4 μg/L，对鱼肉和虾肉的检测限分别为0.047 μg/kg和0.045 μg/kg；回收率（鱼肉）是83.5%～109.3%，批内相对标准偏差范围是5.0%～9.3%，批间相对标准偏差范围是7.0%～7.5%。特异性良好，氯霉素单克隆抗体与棕榈氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考胺的交叉反应率均＜1%。化学发光试剂盒在4℃下保存12个月，IC50和回收率指标均正常，稳定性较好。