米酒中6种醇的气相色谱外标法测定研究

唐开永，周鸿翔*，刘彩婷，陈 烁，王晓丹，邱树毅，肖甜甜

（1.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州茅台酒股份有限公司，贵州 贵阳 550025）

米酒是典型的、以糯米为原料发酵而成的酿造酒，乙醇和高级醇是米酒主要的醇类物质，其含量直接影响米酒的口感及风味。高级醇主要由正丙醇、异丁醇、异戊醇、己醇、β-苯乙醇组成，在发酵过程中经由糖代谢、氨基酸机构化途径形成[1]。研究表明[2-4]，适量的高级醇可以丰富酒的口感及风味，但超过一定浓度时，酒体变得不协调，饮后容易出现头晕、后苦、上头等症状，长时间积累于体内而造成机体损伤[5]，甚至死亡[6]。

目前，发酵酒中高级醇的测定方法有分光光度法、气相色谱（gas chromatography，GC）法及气相色谱-质谱联用（GC-MS）法。米酒酒精度较低，用国标GB/T 13662—2018《黄酒》中的酒精计法测定时，蒸馏过程操作繁琐、浪费材料，且误差大[7]。随着毛细管柱的发展，以其较高的柱效、优异的惰性等优点，被广泛应用[8]。GC对高级醇的测定多采用WAX和FFAP等色谱柱[9]，其研究对象多为啤酒和白兰地[10-11]。国内外对于发酵酒中乙醇及高级醇的分析检测研究较多，曾诗雨等[12]用超纯水处理标样采集色谱数据建立校正表，固相微萃取-气相色谱（solid phase microextractiongaschromatography，SPME-GC）法测定米酒中的乙醇；林玲等[13]采用直接进样，HP-INNOWAX柱测定黄酒中高级醇含量；CHUNG H等[14]采用直接进样，CP WAX-57柱测定韩国米酒中甲醛、高级醇含量；卢珍华等[15]采用蒸馏结合GC的方测定糯米酒中高级醇。但目前气相色谱对乙醇及高级醇测定的研究仅限于成品酒，米酒酿造过程中的乙醇及高级醇检测鲜有研究。无论直接进样或蒸馏后超纯水定容再进样，都有大量水进入色谱柱而造成固定相流失，缩短色谱柱的寿命；对酿造过程中乙醇及高级醇含量测定方法的研究，有利于及时把控米酒酿造情况、改善因米酒高级醇含量高而等实际生产问题。对于米酒酿造业的发展具有深远意义。

本研究以米酒发酵酒为对象，甲醇作为溶剂数倍稀释处理，致力于建立米酒酿造过程中，对乙醇、丙醇、β-苯乙醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇、己醇等多种醇同时测定的方法，为米酒酿造酒在生产中，对酒精度及高级醇含量的控制提供基础数据，对把控米酒酿造生产和产品的控制具有深远意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料

米酒：实验室自制。

1.1.2 试剂

乙醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇、己醇、β-苯乙醇（纯度均≥99.95%）：美国Sigma-Aldrich公司；甲醇（色谱纯）：台湾昌泰有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 7890A型气相色谱仪（配有7693自动进样器、10μL自动进样针、HP-INNOWAX（30m×0.25mm×0.25μm）色谱柱）：美国安捷伦公司；FA1004电子分析天平：上海良平仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

参照《色谱理论基础》[16]，选用不同极性色谱柱：强极性柱HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）[13]、弱极性柱HP-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）[17]、中强极性柱DB-FFAP（30 m×0.25 mm×0.25 μm）[18]作为乙醇及高级醇定量分析的目标色谱柱。由于溶剂甲醇与乙醇沸点较低且较接近，高级醇各组分之间的沸点跨度较宽，选择分流进样、程序升温的方式采集数据，以初始温度（35℃、40℃、45℃、50 ℃、55 ℃），分流比（20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1）、空气流量（200 mL/min、250 mL/min、300 mL/min、350 mL/min、400 mL/min）、升温速率（第一阶段（8℃/min、12℃/min、16℃/min、20℃/min）、第二阶段（30℃/min、40℃/min、50℃/min、60℃/min））等，以分离度R，保留值（k'）及分析时间（tm）为分离柱柱效的依据确定色谱条件。

1.3.2 色谱峰的定性

量取各组分高级醇标准品5 μL、乙醇1 mL分别装入10 mL容量瓶中，用甲醇定容；得到单一标准液；分别取单一标准液1 mL至10 mL容量瓶混合并用甲醇定容。先用混合溶液进样，分析色谱图出峰情况，确定色谱柱以及色谱条件；再单一标准品溶液进样，确定各组分保留时间。

1.3.3 乙醇及高级醇的定量

定量方法：外标法

取乙醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇、己醇、β-苯乙醇，用甲醇定容，配制得到1#～8#梯度浓度6种醇的混合标准溶液。

按照优化的色谱条件，标准品梯度浓度由低到高的顺序：1#～8#标样依次进样，每个浓度进样3次，以各组分标样梯度浓度为横坐标，3次测定峰面积的平均值为纵坐标，建立校正表，得到各组分的定量线性关系；将混合标准溶液不断稀释浓度进样分析，记录信噪信号值，确定各组分的定量限及检出限。

1.3.4 验证试验

（1）重复性和稳定性：取米酒25 mL，用甲醇定容至50 mL，静置30 min，过0.22 μm有机膜，双通道同时进样，每1d测定一次，连续测定5 d，每次重复3次，每次测定结果为3次测定的峰面积均值，并计算各组分的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

（2）精密度：取10 mL实验室发酵米酒加入50 mL容量瓶，用甲醇定容，静置30 min，过0.22 μL有机膜，双通道同时进样，连续进样5次，外标法定量，并计算各组分的RSD。

（3）准确度：量取10 mL的米酒发酵液20份，5份一组（4组），1组用甲醇定容至50 mL，作为本底值，另外3组分别加0.5mL1.3.3中配制的混合标准溶液3#、5#、6#，用甲醇定容为50mL，静置30min，过膜，进样分析。计算各组分的回收率，回收率=（加标样品测定值-样品测定值）/加标值×100%[19]。

1.3.5 酒样的处理及分析

分别量取10mL、5mL、2mL、1mL米酒发酵液于10mL容量瓶中，用甲醇定容稀释（1、2、5、10）倍，静置30 min（沉淀多糖及蛋白质等大分子絮状物），取上清液过0.22 μm有机膜，进样分析。

2 结果与分析

2.1 优化色谱条件

对三根不同极性色谱柱进行柱效分析比较，结果见表1。

表1 色谱柱的分离柱效Table 1 Separation column efficiency of chromatographic columns

HP-5色谱柱的气相色谱图如图1所示，甲醇与乙醇的分离度（R）＜1，k'＜0.2（在tm少的同时，0.2≤k'≤20时，色谱柱分离度效果越好）[20]，两者的分离效果不佳，通过改变色谱条件，也不能改善甲醇与乙醇的分离效果。因此，HP-5色谱柱不适合测定以甲醇为溶剂的乙醇酒样。

图1 HP-5色谱柱测定酒样的气相色谱图Fig.1 Gas chromatogram of wine sample with HP-5 column

色谱柱DB-FFAP和HP-INNOWAX的标准品气相色谱图见图2。

由图2可知，第一个色谱峰为溶剂甲醇，乙醇及各高级醇与酒样谱图一一对应且彼此分离。由表1和图2分析优化得到本实验的最佳气相色谱条件如下：进样量1 μL；分流比为40∶1；进样口、检测器温度250 ℃；氢气流量30 mL/min；空气流量300mL/min；分流流量40mL/min；总流量44mL/min；进样器温度250℃；平均线速度25.812cm/s；柱流量1.0mL/min；程序升温：初始温度45℃，保持3min，16℃/min升温至120℃，保持3 min，以50℃/min升温至220℃，保持2 min。

图2 DB-FFAP（A）和HP-INNOWAX（B）色谱柱条件下混合标准品的气相色谱图Fig.2 Gas chromatogram of mixed standards with DB-FFAP(A)and HP-INNOWAX(B)columns

DB-FFAP和HP-INNOWAX色谱柱的色谱图峰形对称，各高级醇组分均能完全分离，甲醇与乙醇峰均有重叠，通过调节分流比、升温速率、进样量等实现色谱条件，使得甲醇峰与乙醇峰实现完全分离；本研究就色谱柱HP-INNOWAX及色谱柱DB-FFAP采用双通道进样方法做进一步验证实验。

2.2 组分的定量关系及检测限

双通道色谱柱同时进行数据采集，以信噪比为10（S/N≈10）为定量限浓度，接近信噪比为3（S/N≈3）为检测限浓度，以质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，建立线性方程。得到表2所示的线性范围、相关系数R2、定量限（limit of quantitation，LOQ）及检出限（limit of detection，LOD）等。

表2 DB-FFAP和HP-INNOWAX色谱柱分析各组分的线性关系、相关系数、检出限、定量限Table 2 Linear relation,correlation coefficient,LOD and LOQ of each component analysis by DB-FFAP and HP-INNOWAX chromatographic columns

由表2可知，乙醇含量为0.3%vol～19.2%vol，5种高级醇的含量为1.2～204.8 mg/L，DB-FFAP和HP-INNOWAX色谱柱的峰面积与含量的线性关系均良好，各组分的相关系数R2在0.999 01～0.999 86，R2均＞0.999，定量限范围分别为0.42～0.056 mg/L和0.028～0.041 mg/L，检出限范围分别为0.022～0.039 mg/L和0.010～0.024 mg/L，两根色谱柱测定乙醇性能相似，测定高级醇时，HP-INNOWAX色谱柱较DB-FFAP色谱柱的检出限低。说明在一定浓度范围内，两根色谱柱在本研究的色谱条件下，6种醇分析检测的线性关系良好。

2.3 方法的重复性试验

图3 DB-FFAP（A）和HP-INNOWAX（B）色谱柱分析各组分的重现性试验结果Fig.3 Results of reproducibility tests of each component analysis by DB-FFAP(A)and HP-INNOWAX(B)chromatographic columns

采用双通道DB-FFAP和HP-INNOWAX色谱柱对5倍甲醇处理的发酵米酒同时进行5次数据采集，6种醇的峰面积如图3所示。

由图3可知，DB-FFAP和HP-INNOWAX色谱柱各组分的峰面积表现平稳，没有太大差异，且色谱柱DB-FFAP与HP-INNOWAX各组分峰面积的RSD分别在0.1%～1.9%和0.1%～1.5%范围内波动，说明发酵酒样在稀释5倍时，DB-FFAP和HP-INNOWAX色谱柱的重复性均良好。

2.4 方法的精密度试验

采用双通道DB-FFAP和HP-INNOWAX色谱柱对5倍甲醇处理的发酵米酒，同时进样分析测定5次，测定结果见表3。

表3 DB-FFAP和HP-INNOWAX色谱柱分析各组分的精密度试验结果Table 3 Results of precision tests of each component analysis by DB-FFAP and HP-INNOWAX chromatographic columns

由于测定结果的相对标准偏差（relative standard devi ation，RSD）数值越低，方法的精密度越高[21]。由表3可知，在测定稀释5倍的米酒发酵液时，色谱柱HP-INNOWAX各组分的RSD在1.79%～3.39%范围内（＜5%），但DB-FFAP色谱柱除异戊醇的RSD=4.53%外，其他成分的RSD均＞5%，且测定β-苯乙醇的RSD高达13.09%。结果表明，色谱柱HP-INNOWAX测定稀释5倍的米酒发酵液精密度良好。

2.5 方法的加标回收率试验

向样品中加标测定加标回收率验证方法的准确度。测定加入高、中、低3个水平的回收率及平均回收率，结果如表4所示。

由表4可知，6种醇类的平均回收率在90.89%～96.53%范围内，RSD为0.11%～3.02%（＜5%）。结果表明，此方法检测米酒发酵液中乙醇及高级醇含量的误差小，在一定范围内，满足样品测定的要求，表明该方法的测定结果准确度较高。

表4 HP-INNOWAX色谱柱分析各组分的加标回收率试验结果Table 4 Results of standard recovery rate tests of each component analysis by HP-INNOWAX chromatographic column

续表

2.6 米酒样品中6种醇的测定

在发酵前期，发酵体系含大量水系和有机大分子，用甲醇作溶剂分别1倍、2倍、5倍、10倍稀释酒样，解决因直接进样而导致的进样针推阻和柱流失问题色谱柱HP-INNOWAX外标定量测定米酒发酵液不同倍数稀释下各组分的含量，结果见表5。

表5 不同稀释倍数米酒乙醇及高级醇含量测定结果及相对标准差Table 5 Determination results and relative standard deviation of ethanol and higher alcohol contents in rice wine with different dilution ratio

由表5可知，与原液酒样对比，稀释2倍～5倍时RSD值均＜5%，分析结果与原液测定值差异不大，但当稀释10倍浓度时，除异丁醇、异戊醇、己醇RSD＜5%外，其他醇测定值偏差较大。因此，本方法确定以甲醇稀释5倍米酒发酵液为样品前处理，直接进样分析测定米酒中乙醇及高级醇的含量。

3 结论

本研究以米酒为研究对象，建立米酒酿造过程中乙醇及高级醇含量的测定方法，通过优化色谱条件，选择出分离效果较好的色谱柱DB-FFAP和HP-INNOWAX；5倍甲醇稀释处理，双通道色谱柱同时进样分析比较，两根色谱柱的精密度实验验证：色谱柱DB-FFAP的RSD高达16%，色谱柱HP-INNOWAX各种醇的RSD均小于5%，表明DB-FFAP色谱柱不适合本方法对米酒发酵过程对乙醇及高级醇的测定；用HP-INNOWAX色谱柱做高、中、低3种不同加标浓度的回收率试验，平均回收率为90.89%～96.53%，RSD＜5%。与前人研究方法比较，本研究方法样品分析时间短，用时14.88 min，由此表明，HP-INNOWAX色谱柱的稳定性、重现性和准确度均良好，并且省时；综合考虑进样针及色谱柱等耗材的维护及损耗，不同倍数甲醇处理酒样的色谱分析，确定5倍甲醇稀释发酵米酒酒样。该方法省时，高效、稳定、准确，且实用性强，可应用于米酒酿造工业生产上对乙醇及高级醇的实时监测。