冠通方对大鼠心梗后心功能不全心肌细胞凋亡及病理形态的影响

韦 斌，莫雪梅，王 强，叶星江，林洪升，卢健棋，姜 浩

（1.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011；2.武警广西总队医院，广西 南宁 530003；3.广西国际壮医医院，广西 南宁 530201；4.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由于各种原因导致心脏泵血、充盈功能下降而引起的一种临床综合征，是危害人类生命健康的重大疾病。冠通方是广西中医药大学附属瑞康医院和第一附属医院心内科医生在长期的医疗实践中总结出来的中药复方制剂，制剂成分包括生晒参、黄芪、丹参、绞股蓝等药［1］。本研究通过动物实验观察冠通方干预对大鼠心梗后心功能不全心肌细胞的凋亡及病理形态的影响，探讨冠通方对心肌细胞的保护作用及其机制。

1 实验材料

1.1 动物 本研究使用的SD雌性大鼠均从广西医科大学实验动物中心购买（生产许可证号SCXK（桂）2017-0023，体重250～320 g，动物饲料由广西医科大学实验动物中心提供。

1.2 药物与试剂 冠通方颗粒由广西中医药大学附属瑞康医院制剂室生产，分装规格为每包3.5 g（每包含生药4 g）；卡托普利片（中美上海施贵宝制药有限公司生产，国药准字H31022816，规格25mg/片）。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒为德国罗氏公司（Roche）生产；兔抗大鼠Bcl-2、Fas单克隆抗体、即用型SABC免疫组化试剂盒SA1022由武汉博士德生物工程有限公司生产，DAB显色剂为北京中杉金桥生物技术有限公司生产。

1.3 仪器 全自动脱水机（德国Leica，ASP300S），石蜡切片机（德国Leica，RM2245），奥林巴斯显微镜（日本OLYMPUS，BX53），病理图文摄像头（日本OLYMPUS，DP73），Image Pro Plus 6.0计算机图像分析系统（美国Media Cybernetics公司），小动物呼吸机（北京智鼠多宝生物科技有限公司，DW-3000）。

2 实验方法

2.1 分组及给药 本研究动物在手术造模后按随机数字表法分组，手术后3天将大鼠随机分为假手术组、模型组、冠通方组、西药组，每组6只大鼠。术后3天给予灌胃，假手术组、模型组给予生理盐水灌服，冠通方组给予冠通方灌服，西药组给予卡托普利灌服。

冠通方颗粒用量根据人-大鼠临床用药剂量换算公式［2］换算成大鼠用药量，冠通方给药剂量为2.5 g/（kg·d），计算好每只大鼠的用药量，然后将生理盐水溶解为2 ml等量溶液，每天灌胃1次。卡托普利片用量根据人-大鼠临床用药剂量换算公式［2］，给予大鼠的剂量为2.5 mg/（kg·d）。假手术组和模型对照组予常温生理盐水灌胃，每次2 ml。实验大鼠行分笼饲养，每天早上9点灌胃给药，连续给药14 d，于末次给药1 h后取材进行实验。

2.2 心梗后心功能不全大鼠动物模型的制作［3］用10%的水合氯醛（4 ml/kg）麻醉大鼠，麻醉后称重并固定于鼠手术板上，将电极夹紧密接触四肢皮肤监测大鼠心电图。无创气管插管，连接小动物呼吸机进行正压通气，潮气量9 ml，呼吸频率70次/min；呼吸比2∶1。在胸骨左缘扪及心脏搏动处纵行切开皮肤约2 cm，逐层钝性分离皮下组织、肌肉，剪断第3、4肋间开胸，充分暴露心脏。用生理盐水湿棉球保护肺脏组织，小心剥离心包膜，在肺动脉圆锥和左心耳之间，以左冠状静脉主干为标志，尽可能找到冠状动脉前降支，于左心耳根部下方5 mm处以2-0缝合线穿过并结扎左冠状动脉前降支（LAD），以心电图ST段弓背向上抬高大于0.1 mv并持续5 min以上作为结扎成功的标志。清除胸腔内积血，加大潮气量降低呼吸频率鼓肺后，逐层缝合关闭胸腔。假手术组大鼠心肌穿针线后不结扎。

2.3 心肌组织HE染色 处死大鼠，开胸剪下心脏，用生理盐水灌注并冲洗干净，剪下左心室置于10%中性甲醛液中固定48 h，经全自动脱水机脱水14 h，常规石蜡包埋，石蜡切片厚4 μm，常规脱蜡至水，进行HE染色、封片，镜下观察左心室心肌病理改变。

2.4 Bcl-2、Fas蛋白表达的检测 按免疫组化试剂盒说明书进行操作，切片常规脱蜡后、置于枸橼酸盐抗原修复液中热高压修复，3%过氧化氢孵育并封闭，然后分别加入Bcl-2或Fas蛋白抗体4℃过夜，加入生物素化二抗及辣根酶标记链酶亲和素，DAB显色，苏木素复染，脱水透明封片后用计算机图像分析系统检测分析，以细胞质及胞膜内侧出现棕黄色颗粒为阳性颗粒。每只大鼠观察3张切片，每张切片随机观察5个视野（×200），拍照并准确采集视野内全部阳性颗粒，采用Image-pro Plus 6.0分析软件求出平均光密度值。

2.5 心肌细胞凋亡指数检测 原位末端标记法（TUNEL）检测凋亡心肌细胞按有关说明书进行，心肌组织切片（厚5 μm）样本常规脱蜡后，用0.3%过氧化氢溶液封闭30 min，再用20 mg/L蛋白酶K消化心肌膜蛋白及核蛋白后，加入TUNEL反应液，37℃孵育60 min；加入FITC标记抗体，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，封片后用显微镜观察。TUNEL检测细胞凋亡判定标准:正常细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈棕褐色。每只大鼠观察3张切片，每张切片随机观察5个高倍视野（×400），每个视野计算凋亡细胞个数和所有细胞个数，按公式（凋亡指数=凋亡阳性细胞数/总细胞数×100%）进行计算，取其平均值。

2.6 统计学方法 所有数据以均数±标准差（x±s）表示，用SPSS21.0统计软件进行统计分析。方差齐时，多组间比较用单因素方差分析；如方差不齐，多组间比较用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

图1 各组心肌组织HE染色结果（×200）

3.1 各组心肌组织切片HE染色情况比较 假手术组心肌细胞大小正常，排列整齐，形态结构完整，假手术组心肌组织形态结构与正常心肌组织无明显差别。假手术组心肌细胞较小，排列整齐紧凑；模型组心肌细胞增大，排列疏松，细胞质增多，肌纤维增多，心肌纤维横纹粗大，心肌细胞梗死区由纤维组织代替；冠通方组和西药组改变程度较轻；模型组坏死区周围纤维结缔组织增生较冠通方组和西药组明显。见图1。

3.2 各组大鼠心肌组织中Bcl-2和Fas蛋白表达比较 模型组Bcl-2表达均比其他各组低，而假手术组、冠通方组、西药组组间比较无统计学意义；假手术组Fas表达比其余3组低，而模型组较冠通方组、西药组表达均高。提示冠通方与卡托普利片均可以提升Bcl-2及降低Fas表达。详见表1。

表1 各组大鼠心肌组织中Bcl-2和Fas平均光密度值比较

表1 各组大鼠心肌组织中Bcl-2和Fas平均光密度值比较

注:与假手术组相比，①P＜0.05，②P＜0.01；与模型组相比，③P＜0.05

Fas 0.53±0.12 2.35±0.46②1.83±0.24②③1.77±0.21②③组 别假手术组模型组冠通方组西药组n6666 Bcl-2 1.87±0.72 0.92±0.14①1.83±0.47③1.58±0.25③

3.3 各组心肌细胞凋亡情况比较 心肌细胞TUNEL染色后，各组均发现了不同程度的棕褐色凋亡细胞核，与假手术组比较，其余3组细胞凋亡明显增多，其中模型组棕褐色凋亡细胞核为最多，见图2；假手术组心肌细胞凋亡指数比其余3组低，而模型组心肌细胞凋亡指数均高于其余3组，见表2。提示冠通方与卡托普利片均有抑制心肌细胞凋亡的作用。

图2 各组大鼠心肌细胞凋亡情况（×400）

表2 各组心肌细胞凋亡指数比较

4 讨 论

心梗后心肌细胞中的线粒体、肌浆网结构和功能异常，心肌细胞膜的完整性被破坏，细胞间信息传递和离子交换受影响，进而促进心肌细胞凋亡，而心肌细胞的不断凋亡，导致心脏功能不全的发生，心梗后常伴随心功能不全，终末期可发展成为心力衰竭［4］。心力衰竭发生时左室功能不全进行性加重是心肌细胞收缩功能逐渐退化、心肌细胞内部结构受到破坏而发生凋亡的结果，而心肌凋亡可能是心功能下降的根源所在。心肌细胞凋亡使心肌细胞大量丧失，当心肌细胞数量减少到一定程度，必然会导致心力衰竭进行性加重［5］。Bcl-2是一种癌基因，Bcl-2蛋白不能影响细胞增殖，但是能促使细胞在无生长因子的环境下存活，Bcl-2蛋白的表达量增高，能防止细胞凋亡［6］。Bcl-2通过阻滞细胞内钙超载和自由基的生成，干扰线粒体膜的通透性，抑制细胞色素C的释放和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）的激活，能抗氧化并防止细胞凋亡［7-8］。Fas又被称为凋亡蛋白-1，其主要存在T淋巴细胞、髓样细胞和成纤维细胞表面，Fas可和配体FasL特异性结合，能激活信号转导通路，触发细胞凋亡。Fas的表达与生物细胞凋亡密切相关［9-10］。

中医认为，心力衰竭的病位在心，与肺、脾、肾三脏的虚损密切相关，在病情发展进程中可产生痰浊、瘀血等病理产物，可形成痰瘀互结，虚实相兼，相互影响，治疗上应予补气通络、化瘀逐痰为主。冠通方中的生晒参是把新鲜的人参用烘干设备烘干后的人参。人参具有大补元气、补脾益肺、生津止渴、安神益智等功效。人参的主要成分含有人参皂苷，具有抗衰老的作用。人参皂苷通过抗氧化，调节免疫，调节神经系统，影响细胞周期调控因子、衰老基因的表达，防止细胞凋亡等作用来实现抗衰老的作用［11］。黄芪含有多种生物活性成分，包括黄芪皂苷、黄芪多糖等，黄芪皂苷Ⅳ是黄芪正性肌力作用的主要活性成分，不但对正常和心功能受抑制大鼠左室表现正性肌力作用，且对收缩和舒张功能均有改善作用，而不增加心肌耗氧量［12-13］。丹参具有活血通经、祛瘀止痛、清心除烦、凉血消痈的功效。丹参的水溶性成分有清除超氧阴离子和羟自由基的功效，能够抑制或降低脂质过氧化反应；丹参的有效成分中三七皂苷类成分作用于心肌，能有效释放内源性保护物质，让心肌缺血的预适应能力有效提高；丹参酮能对血栓形成进行有效抑制，和三七皂苷类成分协同作用，对心肌进行有效保护，因此可能具有防止心肌细胞凋亡的作用［14］。绞股蓝提取液可提高自然衰老小鼠的SOD活性，提高抑制羟自由基能力，并且能改善自然衰老小鼠的皮肤自然老化现象，表明绞股蓝提取液具有抗自然老化、延缓衰老的作用［15-16］。

本实验结果表明，Bcl-2蛋白在模型组大鼠心肌细胞中表达明显降低，Fas蛋白在模型组大鼠心肌细胞中表达明显增高，与假手术组比较的差异有统计学意义（P＜0.01），用冠通方和卡托普利片干预的大鼠，其心肌细胞Bcl-2蛋白表达明显升高，而Fas蛋白表达显著降低，与模型组比较有统计学意义。提示冠通方与卡托普利片对抑制凋亡基因和促进凋亡基因具有双向调节的作用。冠通方防治心力衰竭的可能分子机制为能上调抑制凋亡基因Bcl-2蛋白的表达、下调促进凋亡基因Fas蛋白的表达，从而抑制心肌细胞凋亡，对心梗后的心肌细胞有一定的保护作用。