微流控环介导等温扩增法在脓毒症患者肺炎克雷伯菌检测中的应用价值

苏华 陈琛 蒋丽娜

[摘要] 目的 探討微流控环介导等温扩增法在脓毒症患者肺炎克雷伯菌检测中的应用价值。 方法 收集2015年7月～2018年5月河北北方学院附属第一医院重症医学科脓毒症患者152例作为研究对象，自然咳痰采集法收集痰液标本99例，经支气管镜抽吸法收集标本53例，分别进行细菌培养及微流控环介导等温核酸检测，根据细菌培养是否分离到肺炎克雷伯菌分为肺炎克雷伯菌组42例和非肺炎克雷伯菌组110例。 结果 细菌培养检出肺炎克雷伯菌阳性率为27.6%（42/152），微流控环介导等温核酸检测法阳性率为38.8%（59/152），后者阳性率高于前者，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。肺炎克雷伯菌组经微流控环介导等温核酸扩增法检出阳性菌37例，其中自然咳痰采集法检出21例，支气管镜抽吸法检出16例，非肺炎克雷伯菌组检出阳性菌22例，其中自然咳痰法检出15例，支气管镜抽吸法检出7例，经支气管镜抽吸法和自然咳痰采集法检测的ROC曲线下面积为0.847和0.836，约登指数前者（0.694）高于后者（0.672）。与细菌培养法的一致性评价（Kappa值为0.604 > 0.600，P < 0.05）比较，两种检测方法有较高的一致性。 结论 微流控环介导等温扩增法在脓毒症患者肺炎克雷伯菌检测中具有快速、灵敏的优势，与传统的细菌培养法有较高的一致性，为临床提供更好的的诊疗依据。

[关键词] 微流控;环介导等温扩增;脓毒症;肺炎克雷伯菌

[中图分类号] R563.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）03（a）-0144-05

[Abstract] Objective To explore the clinical value of microfluidic loop-mediated isothermal amplification detection in the diagnosis of Klebsiella pneumoniae infection in sepsis patients. Methods From June 2015 to May 2018， 152 sepsis patients who were from the department of ICU of the First Affiliated Hospital of Hebei North University were collected， 99 cases of sputum specimens samples were collected by natural cough method， 53 cases were collected by bronchoscopy. All these samples were simultaneously detected by traditional pathogen culture method and microfluidic loop-mediated isothermal amplification method. According to the traditional bacterial culture result， all cases were divided into two group， 42 cases were Klebsiella pneumoniae infection group and 110 cases were non Klebsiella pneumoniae infection group. Results The positive rate of Klebsiella pneumoniae detected by bacterial culture was 27.6%（42/152）， and by microfluidic loop-mediated isothermal amplification detection was 38.8%（59/152）， which was higher than the former， the difference was statistically significant（P < 0.01）. The method of microfluidics loop-mediated isothermal amplification detected 37 positive cases from Klebsiella pneumoniae infection group， including 21 cases natural cough sample and 16 cases bronchoscopy sample， Non Klebsiella pneumoniae infection group was detected by the method of microfluidics loop-mediated isothermal amplification had 22 cases positive samples，including 15 cases natural cough samples and 7 cases bronchoscopy samples. The area under the ROC curve of the bronchoscopy suction method and natural cough collection method was 0.836 and 0.847. The Jordan index of former （0.694） was higher than the latter （0.672）. The Kappa value was 0.604 > 0.600， P < 0.05， indicating a high consistency between the two methods. Conclusion Microfluidic loop-mediated isothermal amplification has the advantages of rapid and sensitive detection of Klebsiella pneumoniae in sepsis patients， which is highly consistent with the traditional bacterial culture method and can provide better clinical diagnosis and treatment basis.

[Key words] Microfluidics; Loop-mediated isothermal amplification; Sepsis; Klebsiella pneumoniae

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）是一种常见的革兰阴性机会致病菌，是引起医院感染的常见致病菌之一，由于其耐药性呈逐年升高趋势，成为导致患者死亡的重要原因，尤其是重症医学科的脓毒症患者，微流控（microfluidics）环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）集成诊断技术是一种新兴的分子诊断技术[1]，目前主要用于病原微生物的快速核酸检测[2-3]，它将微流控的微型化、多通道、易检测、造价低廉等优点与LAMP技术的高灵敏度、简便、耗时短等优点[4]相结合，集成了一个新型的诊断技术。本研究探讨了微流控环介导等温扩增法在脓毒症患者肺炎克雷伯菌检测中的应用价值，旨在为临床医生提供更好的诊疗依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择河北北方学院附属第一医院（以下简称“我院”）2015年7月～2018年5月重症医学科脓毒症患者作为研究对象，收集患者基本临床资料：年龄、性别、住院天数，脓毒症的诊断标准参照1991年美国胸科医师学会和危重病医学会（ACCP/SCCM）制訂的标准。采集患者的痰液标本152例，其中男87例，女65例，平均年龄（68.2±15.3）岁，平均住院时间（12.5±3.2）d，其中自然咳痰法收集痰液标本99例，经支气管镜抽吸法收集痰液标本53例，根据细菌培养是否分离到肺炎克雷伯菌分为肺炎克雷伯菌组42例和非肺炎克雷伯菌组110例。本研究经我院医学伦理委员会批准，并获得家属知情同意。

1.2 肺炎克雷伯菌培养鉴定

严格按照微生物痰液标本的采集及送检标准进行样本采集，采用PHOEN XTMl00全自动细菌分析仪对菌落进行鉴定。质控菌株为大肠埃希氏菌ATCC25922，购自卫生部临床检验中心。

1.3 肺炎克雷伯菌核酸检测

1.3.1 呼吸道病原菌核酸检测  试剂盒（图1）购于北京博奥生物集团有限公司。本试剂盒采用微流控环介导等温扩增技术，利用两对特异性引物，在65℃恒温下，快速完成DNA扩增。加入核酸反应产物检测的荧光染料进行恒温实时荧光分析。

1.3.2 痰液提取方法  标本采集与处理：患者须在抗菌素治疗前采集痰标本。①自然咳痰法：清晨第一口痰液为宜，勿混入唾液或鼻咽分泌物，②经支气管镜抽吸：纤维支气管镜对肺段和亚段进行灌洗，采集肺泡表面衬液，一般不少于5 mL，分别送检细菌培养及微流控环介导等温核酸检测。用于环介导等温检测的标本白细胞数>25个/低倍视野，上皮细胞<10个/低倍视野。

1.3.3 样本检测  痰液液化：痰标本转移到密封容器，加入等体积的10% NaOH，涡旋混匀器震荡混匀，37℃，液化30 min。核酸标本制备：取1 mL液化的样品至1.5 mL离心管，4℃，离心半径8 cm，12 000 r/min，离心5 min，弃上清，加洗涤液混匀离心后弃上清，加入100 μL核酸提取液，混匀后转移到核酸提取管，用核酸快速提取仪提取核酸，4℃，离心半径8 cm，10 000 r/min，离心1～3 min备用。LAMP扩增反应体系：在标本制备区加入34.5 μL待测核酸样品，20 μL LAMP扩增反应试剂，扩增反应总体系为54.5 μL。LAMP扩增反应：50 μL反应体系移入加样口，反应：37℃，3 min;65℃，47 min。LAMP扩增检测结果判断：产物扩增曲线呈S形，快速扩增出现第一个峰值拐点时所对应的时间与原点时间差值为扩增荧光指数增加时间（Tp值），计算得到待检物的阳性预测值，最低检测限为5×102拷贝/反应。扩增肺炎克雷伯菌阳性标本的荧光归一化曲线，见图2，阳性内对照为人源标本的内质控，阳性外对照为无核酸模板的实验质控。

图2   微流控环介导等温核酸扩增法检测肺炎克雷伯菌阳性

荧光归一化曲线

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析，计数资料用百分率表示，两种方法肺炎克雷伯菌检出率间的比较采用配对资料的χ2检验。计算环介导等温扩增法及其不同标本类型检测方法的灵敏度、特异度、漏诊率、误诊率、准确度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比和阴性似然比，评价方法采用ROC曲线，计算曲线下面积和约登指数。实验评价与一致性分析采用Kappa检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺炎克雷伯菌检出情况

细菌培养检出肺炎克雷伯菌阳性率为27.6%（42/152），微流控环介导等温核酸检测法阳性率为38.8%（59/152），后者阳性率高于前者，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。肺炎克雷伯菌组经微流控环介导等温核酸扩增法检出阳性菌37例，其中自然咳痰采集法21例，经支气管镜抽吸法16例，非肺炎克雷伯菌组检出阳性菌22例，其中自然咳痰采集法15例，经支气管镜抽吸法7例。见表1。

表1   不同标本类型微流控环介导等温扩增法检测结果（例）

2.2 两种方法检测肺炎克雷伯菌方法性能评价

以细菌培养为标准检测方法，微流控环介导等温核酸扩增法的灵敏度、特异度、漏诊率、误诊率、准确度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比和阴性似然比分别为88.1%、80.0%、11.9%、20.0%、82.2%、62.7%、94.6%、4.4、0.15，ROC曲线见图3，曲线下面积0.840，约登指数0.681。经支气管镜抽吸法和自然咳痰采集法检测的评价见表2，ROC曲线见图4（A、B）。

2.3 两种方法的一致性分析

两种方法的一致性分析评价Kappa值为0.604 > 0.600（P < 0.05），提示两种检测方法有较高的一致性。见表3。

3 讨论

肺炎克雷伯菌是呼吸道感染的常见致病菌，是引起医院感染的条件致病菌，可引起局部暴发流行。微流控技术结合了微电子、理化等技术，实现分子诊断技术中复杂分析过程的微型化、集成化、连续化检测，可实现生物分子快速、大信息量的检测[5-8]。微流控装置搭载传统PCR技术存在许多局限，如需手工微量移液操作[9];设计安装微型阀和电极[10]增加设备研发成本;依赖昂贵的检测仪器等[11]。LAMP技术能在等温条件下实现一步扩增，由于针对靶基因设计了两对特异引物，反应的灵敏度和特异性大大提升[12]。LAMP的这些优点规避了微流控技术的使用局限，而微流控技术也为LAMP核酸检测系统提供了微量密闭反应空间，也使病原微生物床旁检测（POCT）逐渐成为可能[13]。

本研究显示微流控环介导等温核酸扩增阳性率、灵敏度及特异性均较高，分别为38.8%、88.1%及80.0%、这与李松等[14]的研究结果相近。本研究中微流控环介导等温核酸扩增检出17例肺炎克雷伯菌培养阴性患者，说明存在痰培养阳性率低的可能，近一步的探讨发现这些患者中有12例患者都曾接受过抗生素治疗且治疗效果明显，分析原因可能是抗生素治疗后细菌培养阳性率降低，影响了细菌培养鉴定的阳性率，而核酸检测方法并未受影响，这与钱婧等[15]的研究一致。本研究所用的试剂盒最低检测限为5×102拷贝/反应，检出的阳性率为38.8%，高于传统细菌培养鉴定方法的27.6%，具有一定的优势，二者的临床符合率较高（Kappa值0.604 > 0.600）。本研究对经支气管镜抽吸和自然咳痰法收集标本的检测性能进行了比较，约登指数前者（0.694）高于后者（0.672），说明经支气管镜抽吸法获取的临床标本优于自然咳痰采集法。有研究[16]发现与传统细菌培养比较，微流控环介导等温核酸扩增法更容易检测到混合菌株，原因可能为细菌培养鉴定中可挑选出优势菌的单菌落进行鉴定，而核酸检测的方法却不能，因此对于核酸检测的结果解释仍应该结合患者情况具体分析。

近年来，随着微流控环介导技术的不断发展进步，各种便携检测设备也孕育而生，如手机等电子设备的加入将实现数据的实时传输和储存[17]。微流控环介导等温扩增集成诊断技术将使高质量、低成本的前沿诊断技术实现基层医院的推广，广泛应用于医、教、研领域[18-19]，如疾病监测和管理、病原体鉴定、医源性感染的控制、环境监测、流行病学调查及遗传病的检测等[20]，为推动医疗技术的发展带来新动力。

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（收稿日期：2018-09-30  本文编辑：封   华）