时间分辨荧光法检测乙肝表面抗原LOD及参考区间的验证和建立

黄利君 常凡 莫展

[摘要] 目的 驗证时间分辨荧光分析法检测乙肝表面抗原（HBsAg）的检出限（LOD），评价参考区间的合适性。 方法 自2017年10月～2018年1月对HBsAg二级标准物倍比稀释后采用时间分辨荧光分析法及酶联免疫吸附法（ELISA）进行配对检测，标准物浓度除以稀释后检测结果出现阴性的上一稀释度为LOD，验证厂商的声明，比较两种方法检测同一稀释度样品结果，评估厂商声明的参考区间的合适性;根据美国临床实验室标准委员会（CLSI）EP17-A2规定的方法建立空白限（LOB）及LOD，评价已建立的LOD作为参考区间上限的合适性。 结果 时间分辨荧光法的LOD验证结果为0.1 U/mL，与厂商声明相符。如使用时间分辨荧光检测系统厂商声明的参考区间，标准物稀释3倍后结果判为假阴性，与ELISA检测结果不符。重庆医科大学附属永川医院（以下简称“我院”）检验科建立的HBsAg的LOB及LOD分别为0.048 ng/mL及0.137 ng/mL，如以我院检验科建立的LOD制订参考区间，稀释3倍后两种方法结果一致，均为阳性。 结论 时间分辨免疫荧光分析系统声明的LOD可以接受，但厂商声明的参考区间不适宜，易导致假阴性。检验科应建立自己的LOD来制订参考区间。建议在对病毒标志物定量检测项目进行性能验证时增加参考区间的验证。

[关键词] 乙肝表面抗原;EasyCuta全自动时间分辨免疫荧光分析;LOD;参考区间

[中图分类号] R446.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）03（a）-0149-04

[Abstract] Objectives To verify the detection limit （LOD） of hepatitis B surface antigen （HBsAg） by time-resolved fluorimmunoassay， and to evaluate the suitability of the reference interval. Methods From October 2017 to January 2018， the HBsAg secondary standard substance was diluted and then paired with time-resolved fluorescence method and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） for detection， the detection limit was the last dilution degree with negative test results after standard substance concentration divided by dilution， to verify the manufacturer′s statement， the results of samples with the same dilution degree detected by the two methods was compared， and the suitability of the reference interval declared by the manufacturer was evaluated. According to the American clinical laboratory standards board （CLSI） EP17-A2 method， create blank limits （LOB） and LOD， and the suitability of the established LOD as the upper limit of the reference interval was evaluated. Results The detection limit of time-resolved fluorimmunoassay method was 0.1 U/mL， which was consistent with the manufacturer′s statement. If the reference interval declared by the manufacturer of the time-resolved fluorimmunoassay detection system was used， the standard substance was diluted 3 times and the result was found to be false negative， which was inconsistent with the ELISA test result， the LOB and LOD of HBsAg established in Department Clinical Laboratory， Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University （hereinafter heferred to as "our hospital"）， were 0.048 ng/mL and 0.137 ng/mL， respectively. If the reference interval was established with the LOD established chinical laboratory of our hospieal， the results of the two methods were consistent after 3 times of dilution， and both were positive. Conclusion The detection limit declared by the time-resolved fluorimmunoassay analysis system is acceptable， but the reference interval declared by the manufacturer is not appropriate， which is likely to lead to false negative. The clinical laboratory should establish its own LOD to establish the reference interval. It is suggested to increase the validation of the reference interval in the performance verification of the quantitative detection items of virus markers.

[Key words] Hepatitis B surface antigen; EasyCuta automatic time-resolved fluorescence immunoassay; Limit of detection; Reference interval

目前定量检测病毒标志物的方法（如时间分辨荧光分析法及化学发光方法）虽声称是一个定量实验，但其本质就是一个通过参考区间对定量结果进行阴阳性判断的定性实验，其声明的参考区间的上限其实就是检出限（LOD）。以前关于LOD概念的理解不一，导致各实验室对LOD的建立及验证方法不统一[1-3]。LOD是指样本中可被检测到的最低分析物浓度，可以在规定的可能性条件下予以检出[4-5]，亦即是C95浓度（进行100次检测有95次检测结果为阳性的浓度）[6-7]。LOD代表定性实验的诊断灵敏度，它不同于空白限（LOB）即C50浓度（进行100次检测有50%的结果为阳性，50%的结果为阴性），许多实验室却误把LOB作为LOD。目前虽有关于时间分辨荧光分析法LOD验证的文献报道[8]，但报道误把LOB作为LOD及参考区间下限进行了评估、验证，且我们工作中发现如参照厂商声明的参考区间，一些弱阳性标本在时间分辨检测系统上检测结果为假阴性。乙肝表面抗原（HbsAg）是一个诊断乙肝的重要指标，如因HBsAg参考区间不适而导致乙肝漏检，会给临床诊断、献血人员及器官移植等导致严重后果，因此，有必要对时间分辨检测系统检测HBsAg的LOD及参考区间均进行验证、评价，适当时重新建立LOD和/或参考区间。

1 材料与方法

1.1 一般材料

自2017年10月～2018年1月采用HBsAg二级标准物（购自于国家标准物质网，浓度：0.2 U/mL）作为LOD及参考区间的验证样本，使用样品稀释液制备5个空白样本，并通过空白样本测量数据的统计分析得到的LOB;用HBsAg定量校准品（购自新波生物，浓度：0.21 ng/mL）制备HBsAg浓度值介于LOB（1～4）倍的4个低浓度样本（浓度分别为0.050、0.100、0.015、0.210 ng/mL）作为LOD建立的样本[5，9]。

1.2 仪器与试剂

EasyCuta全自动时间分辨免疫荧光分析仪：（生产厂家：新波生物技术有限公司）;MB-580型酶标仪：（生产厂家：深圳汇松科技发展有限公司）;HBsAg定量检测试剂盒：（生产厂家：新波生物技术有限公司;批号1：8600073730，批号2：86000752000）;乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原诊断试剂盒：（生产厂家：珠海丽珠，批号：B20170820）。

1.3 方法

1.3.1 LOD验证  对HBsAg标准品进行1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的倍比稀释，每个稀释度同时使用时间分辨荧光分析法及酶联免疫吸附实验（ELISA）进行检测，对二者结果进行比较评价，标准物浓度除以稀释后检测结果刚好出现阴性的上一稀释度为LOD。如验证所得的LOD≤厂商声明的LOD，则厂商声明的LOD可以接受，否则不能接受，需重新建立LOD。

1.3.2 参考区间验证  将两种方法检测HBsAg标准品系列倍比稀释后样品的定性结果（即阴阳性结果）进行比较，以ELISA结果作为参考结果，评价厂商提供的参考区间的合适性（时间分辨免疫荧光分析检测系统检测HBsAg是根据厂商提供的参考区间作为阴阳性判断标准，大于参考区间上限即为阳性，参考区间内为阴性），适时建立LOD。

1.3.3 时间分辨检测系统LOD的建立  采用EP17-A2推荐方法[5，9]，对EasyCuta全自动时间免疫荧光分析仪进行校准，严格按照标准作业程序（SOP）文件进行操作，每个空白样本每天测量4次，连续测定3 d，获得60个数据;每个低浓度样本每天测5次，连续测量3 d，获得60个数据。每批测量均做室内质控，剔除失控批次的测量值，纠正失控后重做，按照“1/3”原则剔除离群值，剔除的离群值需重新测量进行补充。设定Ⅰ类错误（α）和Ⅱ类错误（β）均为5%，即α = β = 5%，并根据检测结果的正态分布情况选择使用参数方法或非参数方法建立LOB及LOD。

1.4 统计学方法

使用SPSS 17.0对检测结果进行正态分布性检验，根据结果选择参数或非参数方法建立LOB或LOD。

2 结果

2.1 厂商声明LOD的验证

根据厂商提供的参考区间，标准物稀释2倍时，时间分辨荧光分析法检测结果为阳性，稀释3倍时检测结果为阴性，因此其LOD为0.1 U/mL（0.2/2），与厂商声明的LOD一致，可以接受。此外，根據时间分辨系统厂商提供的参考区间，当室内质控品稀释2倍时，两种方法定性检测结果一致（均为阳性），稀释3倍时，时间分辨荧光分析法定性检测结果为阴性，而ELISA定性检测结果仍为阳性。见表1。

2.2 LOB及LOD的建立

2.2.1 LOB的建立  LOB空白样本测定结果，见表2，经正态性检验呈非正态分布，依据EP17-A2，使用非参数程序估计LOB，LOB = PctB100-α，即第95百分位数值为LOB，得到第95百分位数值为第57和第58个测量结果的均值。将空白样本的60个检测数据按从小到大的顺序排列，第57、58个位置上的检测值均为0.048 ng/mL，故LOB = X57+0.5（X58-X57）=0.048 ng/mL。

2.2.2 LOD的建立  LOD4个低浓度样本测定结果，见表3，经正态性检验呈非正态分布，依据EP17-A2，使用非参数程序估计LOD，即LOD = LOB+DS.β，DS.β是系列低浓度样本测定结果中位数的值与系列低浓度样本测量结果第5百分位数值之差，可得出DS.β = 0.089 ng/mL，则LOD = 0.137 ng/mL。

3 讨论

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的公共卫生问题。中国每年约有30万人死于HBV相关肝癌或肝硬化，占全球HBV相关死亡人数的37%～50%[10-12]，除损伤肝脏外，还可引起肾病、心肌损害和胆管炎等[13-14]。HBV主要传播途径为血液传播（如输血过程中感染）、医源性感染、母婴传播和性传播，最新报道[15-16]表明其在医院医师职业暴露中占首位。HBsAg作为HBV感染的标志物，在0.1 μg/L水平即具有传染性，因此在乙型肝炎的诊断、术前检查、输血前检查和献血人员的筛选方面都有重要的临床意义[17-18]。有报道[19]表明，时间分辨荧光分析法检测HBsAg虽具有较高的灵敏度（96.97%），但在临界浓度附近仍存在阴阳性不一致的情况，据统计学分析，临界浓度各有50%的假阳性和假阴性，因而，验证及建立检测限对于临床实验室能最大限度地检出可疑标本，避免漏检显得十分重要[20]。

因阳性室内质控物或标准物质的浓度单位均为U/mL，临床诊断明确的患者样本，又无法对其HBsAg准确赋值，因此时间分辨荧光检测系统厂商声明的HBsAgLOD（0.1 U/mL）也是使用的U/mL单位，据此，本研究亦采用稀释标准物进行检测的方法进行验证，验证结果与厂商声明的一致。

从本研究ELISA法及时间分辨荧光分析法配对实验结果可以看出：稀释2倍时，二者的定性结果一致。当样本稀释3倍时，二者结果不一致：ELISA测量的S/CO为0.1443，高于Cutoff值（0.105），也超过Cutoff值的灰区范围（0.105±20%），可以非常确切地判断为阳性，而时间分辨测量结果为0.156 ng/mL，如果按照厂商声明的参考区间（<0.2 ng/mL），应该判为阴性。因此，对于浓度在0.137～0.200 ng/mL范围区间的样本使用厂商声明的参考区间易导致假阴性，厂商声明的参考区间不合适，易导致临床漏诊，检验科应该根据自行建立的LOD建立参考区间。

LOD应作为参考区间上限，亦既是C95浓度。我院检验科室自行建立的LOB及LOD分别为0.048 ng/mL及0.137 ng/mL（LOD低于厂家声明的0.200 ng/mL参考区间上限），据此我们建立的参考区间为<0～0.137 ng/mL。在两种方法配对实验中，使用我们建立的参考区间，标准物稀释3倍时，时间分辨检测系统检测结果（0.156 ng/mL）应判为阳性，就与ELISA一致了。当样本稀释4倍时，虽然两种方法检测结果不一致：时间分辨检测结果为阴性（使用本研究LOD即0.137 ng/mL作为参考值），ELISA检测结果为阳性，但结果均处于灰区，处于灰区的结果具有不确定性[21-23]，需进一步确认，因此仅凭这一次实验结果尚不能确定二者测量结果的不一致。

如果采用我院检验科建立的LOD作为判断阴阳性的阈值，从时间分辨荧光法及ELISA配对实验结果可以看出，标准物质（浓度为0.2 U/mL）稀释3倍后两种方法的测量结果一致，仍为阳性，那么时间分辨检测系统的LOD（以国际单位作为浓度单位）应为0.07 U/mL（0.2/3），小于厂商声明的0.1 U/mL，厂商声明亦可以接受。

综上所述，时间分辨免疫荧光法厂商声明的LOD在实验室得到验证，厂商声明的参考区间不合适，易导致误诊，实验室应建立自己的LOB及LOD，应以LOD作为分析阈值，建立参考区间。因此在病毒标志物定量检测项目的性能验证中除验证CL39明确要求的符合率、LOD外，建议实验室增加验证厂商声明的参考区间。

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（收稿日期：2018-07-30  本文编辑：封   华）