乙基多杀菌素及其代谢物在杨梅中的残留及消解动态

吴淑春，梁赤周，虞 淼，徐 永，韩剑众

(1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 310018；2.杭州医学院，浙江 杭州 310053；3.浙江省农药检定管理总站，浙江 杭州 310020)

乙基多杀菌素(spinetoram)是由美国陶氏益农公司开发的一种新型多杀菌素类杀菌剂[1]，有效成分为乙基多杀菌素-J(代号为XDE-175-J)和乙基多杀菌素-L(代号为XDE-175-L)的混合物(结构图1)，乙基多杀菌素-J约占75.5%，乙基多杀菌素-J(22.5℃)外观为白色粉末，乙基多杀菌素-L(22.9℃)外观为白色至黄色晶体，带苦杏仁味，在pH 5～7缓冲溶液中乙基多杀菌素-J和乙基多杀菌素-L都是稳定的。乙基多杀菌素主要作用于昆虫神经中烟碱型乙酰胆碱受体和γ-氨基丁酸受体，致使虫体对兴奋性或抑制性的信号传递反应不敏感直至死亡[2]。乙基多杀菌素具有胃毒和触杀作用，主要用于防治鳞翅目幼虫、蓟马和潜叶蝇等，对小菜蛾、甜菜夜蛾、潜叶蝇、蓟马、斜纹夜蛾、豆荚螟等有好的防治效果。目前乙基多杀菌素悬浮剂、水分散粒剂已在我国水稻、甘蓝、茄子、黄瓜、豇豆、西瓜、杨梅和芒果上已获准登记使用，并已制定了稻谷、糙米、结球甘蓝、茄子、豇豆上的临时最大残留限量[3]。

农药残留联席会议(JMPR)报告研究指出[4]，乙基多杀菌素在植物源样品中的主要代谢物为N-demethyl-175-J和N-formyl-175-J(结构图1)，对乙基多杀菌素进行膳食风险评估，需要乙基多杀菌素-J、乙基多杀菌素-L、N-demethyl-175-J和N-formyl-175-J的残留量。

目前已报道的关于乙基多杀菌素在环境中残留分析方法主要有液相色谱法(LC)[5-8]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[9-10]，这些分析方法均只检测了乙基多杀菌素母体，傅强等[11]用液相色谱-串联质谱法对水稻样品中乙基多杀菌素及其代谢物的残留量进行了研究。王天玉等[12]研究了高效液相色谱法检测杨梅中乙基多杀菌素母体的方法。本研究采用LC-MS/MS分析方法，同时检测杨梅样品中乙基多杀菌素及其代谢物的残留量和降解规律，旨在为乙基多杀菌素在杨中的膳食风险评估、制定农药残留限量标准提供分析方法，也为进一步探究乙基多杀菌素及其代谢物对非靶标生物的毒性效应和农药的合理安全使用提供参考依据。为此，我们在浙江省台州市、浙江省宁波市、福建省建阳市、福建省建瓯市开展了60g/L乙基多杀菌素悬浮剂在杨梅上的残留田间试验。

图1 乙基多杀菌素及其主要代谢物结构式

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 药剂及试剂 标准品96.7%的乙基多杀菌素(其中乙基多杀菌素-J 76.7%，乙基多杀菌素-L 20%)、98%的N-Formyl-175-J和99%的N-Demethyl-175-J，乙腈(HPLC级),甲醇(HPLC级)，氯化钠(AR级)，二氯甲烷(AR级)，乙酸铵(色谱纯)，乙酸(分析纯)，Strata NH2柱(500mg/6mL)，微孔有机滤膜(0.22 μm)。

1.1.2 仪器设备 液相色谱-串联质谱仪(LC-MS-MS)(Waters Xevo TQ)，氮吹仪(N-EVAP 112)，电子天平(PL202-L Ⅲ)，超纯水净化系统(Milli-Q)，漩涡混合器(IKA)，调速多用振荡器(HY-2)，电热恒温水浴锅。

1.2 田间试验设计 按农药残留试验准则要求设试验小区，3株杨梅树为1个试验小区，每个处理3个小区重复，小区间设保护行，同时设不施药小区对照。60g/L乙基多杀菌素悬浮剂防治杨梅果蝇，企业推荐使用药量为有效成分40mg/kg，喷雾施药1次。

1.2.1 消解动态试验 杨梅成熟一半大小时，按有效成分60mg/kg的剂量均匀喷雾施药1次，施药后2h,1、2、3、5、7、10、14、21d，按照残留试验准则果树样品采样要求，在试验小区内采摘生长正常、无病害的杨梅果实，每小区采摘量≥2kg。

1.2.2 最终残留试验 杨梅成熟前半个月左右，按有效成分40和60mg/kg施药剂量，各施药1次和2次，施药间隔7d。末次施药后1、2、3、5、7d，按照残留试验准则果树样品采样要求，在试验小区内随机采摘生长正常、无病害的杨梅果实，每小区≥2kg。

1.3 分析方法

1.3.1 样品前处理 田间样品处理：田间样品采集后，8h内运回实验室。杨梅去核后用食物调理机打成均匀浆状，150g样品2份，分别装入封口样品容器中，-20℃冻存。

提取与净化：称取处理好的杨梅试样25.0g(精确至0.01g)于250mL烧杯中，加入50.0mL乙腈，高速匀浆2min，用滤纸过滤至装有5～7g氯化钠的100mL具塞量筒中，塞紧后剧烈震荡1min，在室温下静置30min，使水相和乙腈相分层，从具塞量筒中吸取上层有机相10.0mL于50mL烧杯中，置于80℃水浴锅上，氮吹至近干，加入2.0mL甲醇:二氯甲烷(1∶9，V/V)溶剂，充分溶解，待净化。将氨基柱用4.0mL甲醇+二氯甲烷(V∶V=10∶90)预洗，当液面到达柱吸附层表面时，加入上述待净化溶液净化，洗脱液用15mL离心管收集，洗烧杯用4.0mL甲醇+二氯甲烷(V∶V=10∶90)洗涤2次并过柱。然后将离心管置于氮吹仪，水浴温度为50℃，氮吹蒸发至近干，甲醇定容至5mL，在混合器上混均后，用0.22μm滤膜过滤，LC-MS-MS测定。

1.3.2 液相色谱条件 色谱柱：Phenomenex XB-C18(100mm×2.1mm×2.6μm)；流动相：甲醇(A)和5mmol乙酸铵-0.1%乙酸缓冲溶液(B)；流动相速度：0.2mL/min；柱温：35℃；进样体积：5μL。液相梯度洗脱程序(表1)。

表1 液相梯度洗脱程序

1.3.3 质谱条件 离子源：电喷雾离子源；离子源温度：150℃；电离方式：ES+；监测方式：MRM；毛细管电压：3.0kV；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流速：800L/h；锥孔反吹气流速：40L/h；碰撞气流速：0.15mL/min；定量方式：外标法。质谱条件(表2)。

表2 乙基多杀菌素测定的ES-MS-MS条件

*定量离子

1.3.4 标准曲线 将乙基多杀菌素及其代谢物分别溶解于甲醇，配制成500mg/L的母液，再分别移取1mL各母液至50mL容量瓶，甲醇定容，配成10mg/L的混合标准溶液，然后用甲醇稀释成0.02、0.1、0.2、1.0、2.0μg/L的系列混合标准工作溶液，按1.3的仪器条件测定。以进样质量浓度(x)为横坐标、响应值(y)为纵坐标绘制标准工作曲线，外标法定量。

1.3.5 添加回收 向空白杨梅样品中分别添加0.05、0.5、1.0mg/kg的乙基多杀菌素及其代谢物混合标准工作溶液(在此添加水平下，乙基多杀菌素-J的添加浓度相当于0.04、0.4、0.8mg/kg，乙基多杀菌素-L的添加浓度相当于0.01、0.1、0.2mg/kg)，采用所建立的方法测定其添加回收率及相对标准偏差。每个添加水平重复5次，同时设空白对照。

2 结果与分析

2.1 方法的线性范围 在0.02～2.0μg/L范围内，以监测离子峰面积(y)为纵坐标，进样浓度(x)为横坐标绘制标准曲线，乙基多杀菌素及其代谢物线性关系良好，相关系数(R2)在0.993 3～1.0之间(表3)。

表3 乙基多杀菌素及其代谢物的标准曲线方程

2.2 回收率和精密度 乙基多杀菌素及其代谢物在杨梅样品中的添加回收试验结果(表4)，当乙基多杀菌素-J 添加浓度为0.04、0.4和0.8mg/kg，乙基多杀菌素-L 的添加浓度为0.01、0.1、0.2mg/kg，代谢物的添加水平为0.05、0.5、1.0mg/kg，平均回收率在82.6%～96.6%之间，相对标准偏差为3.3%～7.4%之间，方法的精密度和准确度均较好，符合农药残留分析的要求[13]。乙基多杀菌素-J和乙基多杀菌素-L在杨梅样品中的定量限分别为0.04mg/kg和0.01mg/kg，代谢物N-demethyl-175-J和N-formyl-175-J的定量限为0.05mg/kg。杨梅添加回收试验典型谱图(图2～图4)。

表4 乙基多杀菌素及其代谢物在杨梅中添加回收率及相对标准偏差

图2 乙基多杀菌素及其代谢物标准溶液(0.1mg/L)的MRM质谱图

图3 杨梅空白样品的MRM质谱图

图4 杨梅添加样品(0.05mg/kg)的MRM质谱图

2.3 消解动态试验 60g/L乙基多杀菌素悬浮剂以有效成分60mg/kg剂量喷雾施药，浙江台州、浙江宁波、福建建阳、福建建瓯4试验地杨梅中的乙基多杀菌素的降解符合一级反应动力学方程，相关系数(R2)在0.929 8～0.976 5之间，半衰期为0.9～2.6d，降解速度较快。乙基多杀菌素在杨梅中的消解动力学参数(表5)。

表5 乙基多杀菌素在杨梅中的消解动力学参数

2.4 最终残留试验 最终残留试验结果表明，60g/L乙基多杀菌素悬浮剂分别按照40和60mg/kg的剂量，施药1次和2次，施药后1、2、3、5、7d，杨梅中乙基多杀菌素(乙基多杀菌素-J和乙基多杀菌素-L之和)最终残留量分别为<0.05～0.38、<0.05～0.39、<0.05～0.32、<0.05～0.19、<0.05～0.11mg/kg，乙基多杀菌素在杨梅中的最终残留规律明显，残留量随着采收间隔期的延长而降低。代谢物N-demethyl-175-J和N-formyl-175-J的残留量均<0.05mg/kg。乙基多杀菌素在杨梅中残留量详细数据(表6)。

表6 乙基多杀菌素在杨梅中的残留量

3 结论与讨论

3.1 果蝇是对杨梅生产影响最大的虫害之一，尤其是杨梅上市前期。乙基多杀菌素对果蝇的防治有很好的效果[14]，从本试验结果看，乙基多杀菌素在杨梅中的平均消解半衰期只有0.9～2.6d，降解速度非常快，这对保证消费者安全非常有利。

3.2 目前我国、CAC及其他国家都未规定乙基多杀菌素在杨梅上的最大残留限量。GB 2763-2018.1中规定了乙基多杀菌素在相关水果上的临时最大残留限量分别为：橙子0.07mg/kg,仁果类水果0.05mg/kg,桃和油桃0.3mg/kg,蓝莓0.2mg/kg,覆盆子0.8mg/kg,葡萄0.3mg/kg。根据试验结果，用药量40～60mg/kg，施药1～2次，末次施药后7d，乙基多杀菌素在杨梅中的最终残留量为<0.05～0.11mg/kg。建议我国乙基多杀菌素在杨梅上的最大残留限量值为0.5mg/kg。

3.3 建议使用60g/L乙基多杀菌素悬浮剂防治杨梅果蝇，有效成分用药量40mg/kg，施药1次，安全间隔期7d。