七种微小RNA在良恶性肺结节鉴别诊断中的价值

史佳民， 刘 娣， 范理宏

(1. 南京医科大学，南京 211166； 2. 同济大学附属第十人民医院呼吸科，上海 200072；3. 同济大学附属上海市肺科医院胸外科，上海 200433)

随着民众健康意识的提高和低剂量螺旋CT的逐渐普及，肺部结节的检出率大幅提高。肺结节是影像学上直径<3cm的圆形或类圆形病灶，可单发或多发，病理上分为良性(如钙化、错构瘤等)与恶性(如腺癌、鳞癌等)两大类[1]。但是肺结节尤其是肺小结节缺乏有效的诊断手段。目前用于诊断肺结节性质的手段包括支气管镜、肺穿刺活检等[2]，一方面阳性诊断率不高，另一方面均是有创手段，增加了患者的经济及心理负担。

近年来，大量研究表明微小RNA(microRNA，miRNA)具有多种重要的调节作用[3]，如抑制或促进肿瘤生长发展。本课题组已对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)病例与健康人[4]及良性肺疾病[5]病例的血浆miRNA表达谱进行了分析，筛选出了具有诊断价值的miRNA[6]。本研究基于以上结果，检测270例早期NSCLS和327例肺部良性结节7种循环血miRNA的表达水平，进一步验证其鉴别良恶性肺结节的价值，并筛出灵敏度、特异度最高的指标，以辅助诊断早期NSCLS。

1 资料与方法

1.1 一般资料

所有入组患者血样与临床资料均于2017年3—5月收集于同济大学附属上海市肺科医院。病例采集于胸外科、呼吸内科和肿瘤科所有拟行手术且影像学上最大直径≤30mm的肺结节患者，共800例，于术前1周采集血样。入选标准： (1) 病理诊断明确；(2) 结节直径≤30mm；(3) 入组TNM分期为T1N0M0；(4) 无其他肿瘤病史；(5) 术前未进行放化疗。排除标准： (1) 拒绝参与研究者；(2) 病理为不典型增生或混合小细胞肺癌者；(3) 合并急性感染、支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘等。据病理结果符合入组标准者共597例，其中270例NSCLS患者，327例良性结节患者。NSCLS组中腺癌200例，鳞癌70例。良性结节组中错构瘤2例，肉芽肿49例，炎性假瘤103例，纤维增生74例，其他99例。NSCLS组和良性结节组样本在年龄方面差异无统计学意义，性别差异有统计学意义，见表1。本研究获得同济大学附属上海市肺科医院伦理委员会批准。

1.2 实验步骤

患者晨起空腹采集5mL全血，4℃，3000r/min，离心15min(离心半径5.8cm)，提取血浆，-80℃冰箱保存。本研究使用miRNeasy Serum/Plasma kit RNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司)，按照使用说明，从200μL的患者血浆中提出14μL总RNA，然后使用NanoDrop 2000微量分光光度计测定浓度与纯度。使用miRNA反转录试剂盒(上海灏勤生物公司)反转录得到20μL cDNA(反应体系： 总RNA 5μL，反转录缓冲液4μL，dNTP 4μL，特定缓冲液4μL，茎环引物1μL，最后加RNase-Free，将总体积补至20μL)。然后使用Eppendorf MCpro进行反转录(42℃孵育40min，70℃孵育15min)。接着使用miRNA荧光定量检测试剂盒(上海灏勤生物公司)进行反转录RT-PCR(反应体系： cDNA 1μL，探针和引物预混液1μL，缓冲液10μL，最后加RNase-Free，将总体积补至20μL)。最后使用ABI 7900实时荧光定量PCR以95℃ 30s、95℃ 5s、60℃ 30s进行45个循环来扩增。

采用相对定量法(以GAPDH为内参)对患者血浆中7种miRNA(miR-15b-5p、miR-16-5p、miR-17-5p、miR-19a-3p、miR-20a-5p、miR-92a-3p、miR-146b-3p)含量进行分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 miRNAs及两两差值表达

13组miRNA(miR-15b-5p、miR-16-5p、miR-92a-3p、miR16-17、miR16-19、miR16-20、miR19-92、miR20-92、miR17-92、miR15-16、miR15-92、miR92-146、miR16-146)在NSCLS组表达与良性结节组中差异有统计学意义(均P<0.05)，其余表达差异无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

2.2 NSCLS与良性结节的诊断试验

将上述13组在NSCLS组与良性结节组中有显著表达差异的miRNA进行灵敏度与特异性进行分析，结果发现与良性结节组比较，miR16-20、miR16-19、miR20-92对NSCLS的诊断价值位居所有指标的前3位，见表2。

2.3 NSCLS与良性结节的诊断试验的单、多因素Logistics回归结果

进一步将7组miRNAs进行单因素与多因素Logistics回归分析，结果显示在校正年龄、性别因素后，miR-15b-5p(OR=2.17)、miR-16-5p(OR=2.33)、miR-17-5p(OR=5.68)、miR-19a-3p(OR=3.04)、miR-146b-3p(OR=2.95)与NSCLS存在显著的关联(P<0.05)。miR-16-5p、miR-17-5p、miR-19a-3p的表达量越低，NSCLS风险越大；miR-15b-5p、miR-146b-3p的表达量越高，NSCLS风险越大。见表3。

2.4 miRNAs联合诊断

联合位居NSCLS诊断价值前3位的miR16-19、miR16-20、miR20-92进行分析。根据ROC曲线，miR16-20的AUC最高为0.71，说明其诊断价值最高。miR16-20/miR16-19、miR16-20/miR16-19/miR20-92联合诊断均能提高灵敏度(81.8%、86.2%)，可辅助NSCLC的早期临床筛查。miR16-20+miR16-19、miR16-20+miR16-19+miR20-92联合诊断均提高诊断特异度(84.3%、 92.8%)，可辅助可疑肺结节的确诊，见表4。

表1 NSCLS与良性结节的基线信息比较

因素NSCLS(n=270)良性结节(n=327)χ2/tP性别8.790.003 男135(50.0%)203(62.1%) 女135(50.0%)124(37.9%)年龄/岁59.01±11.5657.59±15.521.270.204miR1629.28±2.8027.92±3.195.55<0.001miR9230.27±3.2428.89±3.115.18<0.001miR1531.98±2.8431.49±2.122.350.019miR16-17-2.56±3.17-3.62±1.964.51<0.001miR16-19-3.62±1.88-4.63±2.016.19<0.001miR16-20-3.62±2.15-4.73±1.996.37<0.001miR19-922.78±2.443.54±2.01-3.98<0.001miR20-922.69±3.193.80±2.55-4.53<0.001miR17-921.75±2.782.51±2.08-3.460.001miR15-162.70±3.303.57±3.57-3.070.002miR15-921.70±3.892.61±3.57-2.920.004miR92-146-5.70±3.29-6.42±3.712.410.016miR16-146-6.50±3.78-7.27±4.462.160.031

仅列出两组表达差异有统计学意义(P<0.05)的miRNA

表2 NSCLS与良性结节的诊断试验结果

(续表2)

仅列出两组表达差异有统计学意义(P<0.05)的miRNA

表3 NSCLS与良性结节的单、多因素Logistics回归分析结果

#为男比女；$为连续变量；a为低比高；b为高比低；B： 回归系数；SE： 标准误；OR： 比值比

表4 联合诊断分析结果

a: miR16-20和miR16-19；b: miR16-20和miR16-19和miR20-92;c: miR16-20或miR16-19;d: miR16-20或miR16-19或miR20-92

3 讨 论

低剂量螺旋CT的普及大大提高了肺结节的检出率。由于肺结核、肺炎、肺脓肿、炎性假瘤等多种良性疾病与肺癌影像学上均可表现为圆形或类似圆形病灶，导致临床上肺结节的性质很难被确诊。胸部CT仅可筛出肺结节，根据影像学形态推测其性质，并不能诊断其性质。目前用于诊断肺结节性质的方式包括支气管镜、肺穿刺活检等，阳性诊断率不高且均为有创手段，增加了患者的经济及心理负担。

本研究验证了外周循环血中的miR-15b-5p、miR-16-5p、miR-17-5p、miR-19a-3p、miR-20a-5p、miR-92a-3p、miR-146b-3p对良恶性肺结节具有鉴别诊断价值，即miR-16-5p、miR-17-5p、miR-19a-3p的表达量越低，NSCLS风险越大；miR-15b-5p、miR-146b-3p的表达量越高，NSCLS风险越大。并进一步进行差值法分析，筛出了miR-16-5p与miR-20a-5p的差值即miR16-20是最具辅助诊断早期NSCLS价值的指标(AUC： 0.71，灵敏度： 77.3%，特异性： 65.4%)。另外，对位居NSCLS诊断价值前3位的miR16-19、miR16-20、miR20-92进行联合诊断分析，结果显示：miR16-20/miR16-19、miR16-20/miR16-19/miR20-92联合诊断均能提高灵敏度，可辅助NSCLC的早期临床筛查。miR16-20+miR16-19、miR16-20+miR16-19+miR20-92联合诊断均提高诊断特异度，使辅助可疑肺结节的确诊成为可能。

既往国内外已有大量研究表明miRNA表达差异与肺癌有高度相关性[7-8]。例如Zhang等[9]收集患者肺肿瘤组织和相邻的非肿瘤组织进行miRNA和mRNA微阵列分析，发现7种可用于诊断肺癌的miRNA(miR-205-5p、miR-3917、miR-27a-5p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30c-2-3p、miR-30d-5p，AUC分别为0.73、0.66、0.64、0.76、0.77、0.73、0.78)；从AUC来看，诊断价值有高于本研究的miR16-20(AUC为0.71)，也有低的，但总体来说，肿瘤组织及癌旁组织miRNA的诊断价值可能高于外周血miRNA。Leidinger等[10]通过高通量qRT-PCR和微阵列分析发现33种miRNA在NSCLS患者外周血中的表达与COPD患者外周血中的表达存在明显差异，用于两种人群间的鉴别诊断的AUC为0.91，特异性为88.3%，灵敏度为86.9%。该研究miRNA种类繁多，虽然诊断价值高，但临床可行性有待探究。已有研究发现miRNA替代疗法，即恢复或下调特定miRNA的表达水平，从而恢复丧失的肿瘤抑制基因功能。Markou等[11]发现MRX34是第一个用于miRNA替代疗法的脂质体，通过静脉注射可产生miR-34模拟物，可用于无法切除的原发性肝癌或肝脏受累的实体癌症患者，该药物已经进入人体临床试验期。另外，miR-21抑制剂也被发现并用于肝细胞癌的治疗；同时，研究发现miR-21抑制剂抑制了NSCLS异种移植模型中瘤体的生长，说明miR-21可能具有潜在的抗NSCLS的治疗价值。

本研究是一项前瞻性研究，相较于一般的回顾性研究，有统一的入组及诊断标准、检测标准和评判标准，使研究结果更客观。同时本研究样本量大，并运用多种统计学方法进行分析，研究结果更加全面。另外，外周循环血miRNA不仅取材简便，适用于各类型患者，无特殊禁忌，而且灵敏度与特异性也较高。但本研究是一项非随机对照的单中心研究，证据级别有待提高，需更大规模的、多中心的病例来验证结论。

本研究发现外周血中7种miRNA(miR-15b-5p、miR-16-5p、miR-17-5p、miR-19a-3p、miR-20a-5p、miR-92a-3p、miR-146b-3p)在良恶性肺结节的诊断中有较高的灵敏度和特异度。如果能进一步提高检测方法的灵敏度与特异性，这7种miRNA将来可能成为辅助诊断早期NSCLS可靠的生物标记物。