Caspase-3在黄鳝性腺性逆转过程中的表达及定位分析

何 智，何治德，2，何 亮，阮会斌，李 松，严太明

(1.四川农业大学动物科技学院，成都 611130；2.泸州市农业农村局，四川 泸州 646000)

半胱氨酸蛋白酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)是Caspase家族中最重要的凋亡执行者[1]，活化后直接参与切割细胞多种结构蛋白和功能蛋白，引起细胞以凋亡的形式解体[2，3]。哺乳动物Caspase-3参与了滤泡细胞凋亡过程[4]，在凋亡中晚期表达量明显升高[5，6]。同样，鱼类卵母细胞凋亡过程也需要Caspase-3的参与[7]。三斑海猪鱼(Halichoerestrimaculatus)由雌性向雄性转变期卵母细胞中检测到Caspase-3的大量表达[8]。热应激诱导银汉鱼(AtherinableekeriGünther)卵母细胞凋亡过程中，Caspase-3活性与卵母细胞的凋亡具有明显的同步性[9]。

黄鳝(Monopterusalbus)隶属于合鳃鱼目(Synbgranchiformes)合鳃鱼科(Synbranchidae)黄鳝属(Monopterus)[10]，存在由雌性性腺向雄性性腺转变的天然性逆转现象。研究证实黄鳝性逆转过程伴随着性腺的凋亡[11]，但其凋亡具体机制目前尚不清楚。本研究通过克隆caspase-3的序列，检测其mRNA表达水平和蛋白相对含量的变化，并定位其在不同发育时期的卵母细胞的表达位置，探究Caspase-3与黄鳝性逆转的相关性，期望为揭示黄鳝性逆转机制提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用黄鳝购自于四川省成都市温江区瑞航农贸市场，分别于2017年1月—12月每月取样1次，每次取样60尾左右。挑选体质健康、不同规格的黄鳝于四川农业大学水产养殖系实验室暂养24 h后，进行不同发育时期性腺样本的收集。性腺组织一部分使用包恩氏液固定，用于发育时期鉴定和免疫组化定位；另一部分液氮速冻后，-80 ℃保存备用。

1.2 性腺发育时期鉴定和样本筛选

参照肖亚梅的报道[13-14]，采用石蜡组织切片进行性腺发育时期的鉴定，从采集的样本中挑选卵黄生成中期、间性早期、间性中期、间性晚期和雄性时期的性腺样本用于本实验。

1.3 总RNA提取与cDNA第一链合成

使用Invitrogen公司的Trizol Reagent进行总RNA提取，cDNA第一链合成使用Thermo公司revertAid First Strand cDNA Synthesis Kit进行。

1.4 caspase-3基因中间片段的克隆和序列分析

根据已报道的大黄鱼(Larimichthyscrocea)、鳜(Sinipercachuatsi)、黑班小丑鱼(Amphiprionmelanopus)、红鳍东方鲀(Takifugurubripes)、大西洋鲑(Salmosalar)、斑马鱼(Daniorerio)和唐鱼(Tanichthysalbonubes)等鱼类的caspase-3基因序列设计简并引物：F：5′-AACAACAAGAACTTTGA-3′与R：5′-ABGCRTAGAGGAAGTC-3′，引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。反应体系：cDNA 模板l.0 μL，正向引物(10 μmol/L)0.4 μL，反向引物(10 μmol/L)0.4 μL，2×Mix(0.1 U/μL)10.0 μL，H2O 8.2 μL。PCR反应条件为：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；52 ℃，30 s；72 ℃，90 s，35个循环；72 ℃，30 min；12 ℃，forever。PCR结束后取4 μL产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析。将目的产物送往成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。

用BlastX、SeqMan软件将测序结果与其他物种比对，DNAMAN软件预测编码氨基酸序列，MEGA 5.0软件进行同源氨基酸序列比对，采用邻位连接法(Neighbor-joining method)构建系统进化树(Bootstraps=1 000)。

1.5 不同发育时期性腺caspase-3表达分析

使用获得的基因序列片段，以及黄鳝elongation factor-1-α(ef1α)和ribosomal protein L17(rpl17)作为内参基因，设计定量检测引物(表1)。采用双标准曲线法计算基因的相对表达量[15]。数据统计采用SPSS19.0统计分析软件Tukey法进行多重比较，数据的表示方法为平均值±标准误(Mean±SEM)，显著性水平为0.05，每个数据均来自5个生物学重复。

表1 黄鳝caspase-3基因定量分析引物

1.6 Caspase-3相对含量测定

将-80 ℃保存的性腺组织样本融化后保持在2～8 ℃，加入一定量的磷酸缓冲液(PBS，0.01 mol/L，pH7.4)后用匀浆器充分匀浆。3 000 r/min，离心2 min，收集上清备用。

样品中蛋白含量测定采用上海酶联生物科技有限公司提供的鱼半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒进行。同时，用牛血清白蛋白(BSA)作为蛋白标准品，采用BCA总蛋白浓度测定试剂盒测定样品中可溶性总蛋白含量。样品中Caspase-3蛋白的相对含量为单位体积匀浆液中酶含量和可溶性总蛋白含量的比值。

1.7 Caspase-3免疫组化定位

Caspase-3抗血清选用抗原与黄鳝肽段具有较高的同源性兔抗血清，购买于艾博抗(上海)贸易有限公司(Abcam公司产品，编号为ab13847)。

石蜡切片经脱蜡至水化，用新配置的3% H2O2室温(24 ℃)孵育20 min，以去除内源性过氧化物酶，PBS(pH7.4)浸洗3次(3 min/次)；0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)95 ℃加热，并持续15 min，进行抗原修复，PBS浸洗3次(3 min/次)。正常山羊血清封闭液室温孵育20 min；滴加第一抗体(PBS 500倍稀释)，37 ℃放置2 h，PBS浸洗3次(3 min/次)，滴加第二抗体(羊抗兔IgG，武汉博士德公司产品，PBS 1 000倍稀释)，37 ℃孵育1 h，PBS浸洗3次(3 min/次)；DAB(武汉博士德公司产品)显色，苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封片，显微镜下观察结果。阴性对照用PBS代替第一抗体。

2 结果

2.1 Caspase-3生物信息学分析

获得黄鳝caspase-3核苷酸序列长度为432 bp，编码氨基酸144个。基于NJ法构建Caspase-3氨基酸序列系统进化树结果显示，黄鳝与大黄鱼(L.crocea)和鳜(S.chuatsi)等聚为一支，亲缘关系较近(图1)。

图1 黄鳝和其它物种Caspase-3的NJ系统进化分析

2.2 Caspase-3在不同发育时期黄鳝性腺中的表达分析

黄鳝caspase-3 mRNA在雌性性腺向雄性性腺发育的过程中均有表达，随着雌性性腺向雄性性腺的发育表达量呈下降的趋势，并表现出明显的雌雄差异(P<0.05)。其中，卵黄生成中期、间性早期和间性中期性腺的表达量差异不显著，但高于间性晚期和雄性性腺(图2)。

图2 黄鳝caspase-3 mRNA在不同发育时期性腺中的表达分析

2.3 黄鳝不同发育时期性腺中Caspase-3相对含量

Caspase-3相对含量与黄鳝性腺性逆转过程关系密切。在性逆转过程中Caspase-3相对含量呈上升的趋势，在间性晚期达到极大值(图3)。

图3 黄鳝Caspase-3在不同发育时期性腺中的相对含量

2.4 不同发育时期黄鳝性腺中Caspase-3定位分析

Caspase-3在黄鳝各发育时期性腺中的定位结果见图4。在卵黄生成期黄鳝性腺中，Caspase-3主要分布在卵黄积累期卵母细胞细胞质，初级生长期卵母细胞的细胞质和细胞核(图4A，a)。间性早期和间性中期黄鳝性腺中，Caspase-3信号主要分布皮质小泡期卵母细胞的细胞核和颗粒细胞、初级生长期卵母细胞的细胞质和细胞核(图4B，b；图4C，c)。在间性晚期黄鳝性腺中，Caspase-3信号主要分布在初级生长期卵母细胞的细胞质和细胞核(图4D，d)。在阴性对照中未观察到Caspase-3明显的阳性信号(图4E)。

图4 黄鳝Caspase-3在不同发育时期性腺中的定位

3 讨论

已有资料表明，哺乳动物生殖细胞在发生过程中的大量死亡或丢失是属于细胞凋亡，这一过程与Caspase-3等Caspases家族蛋白的表达调控密切相关[16]。小鼠和牛卵巢中卵泡闭锁时，Caspase-3的表达能导致凋亡细胞基因组DNA的特异性降解[17]，猴和绵羊卵母细胞凋亡程度与Caspase-3活性呈正相关[6，18]，在人卵巢颗粒细胞中凋亡过程中也存在类似的现象[18]。同样，Caspase-3在鱼类卵母细胞的凋亡过程中也扮演了重要角色[20，21]。三斑海猪鱼性腺由雌性向雄性变化过程中，卵母细胞凋亡与Caspase-3蛋白表达关系密切[8]。热应激条件下，银汉鱼卵母细胞凋亡与Caspase-3大量表达有关[9]。黄鳝Caspase-3在不同发育时期性腺中均有表达且与性逆转具有明显的同步性，这表明Caspase-3参与了黄鳝性腺性逆转过程，并和性腺中卵母细胞的凋亡关系密切。

Caspase-3作为细胞凋亡通路中非常关键的效应分子，在细胞未发生凋亡时，以无活性的酶原形式存在，而当细胞发生凋亡时，Caspase-3被活化[22]。绵羊卵母细胞受到凋亡促进作用时，Caspase-3活性显著升高[18]。猴和小鼠卵母细胞凋亡晚期的Caspase-3活性显著高于凋亡早期[5-6]。本研究中，caspase-3表达水平在卵黄生成期最高，在性逆转过程中的间性晚期最低。但Caspase-3相对含量则呈现相反的表达趋势,随着性逆转的发生，其相对表达量呈上升的趋势，表现出与性逆转的高度同步性，并在间性晚期达到极大值。由此推测，在黄鳝性逆转开始前就已有大量的Caspase-3酶原储备，随着性逆转开始，大量的酶原活化，并参与黄鳝卵母细胞的凋亡。

在人胎儿卵巢组织中，Caspase-3阳性信号在卵细胞内均有表达，主要定位于卵细胞的细胞质，少量表达于细胞核。此外，胎儿卵巢内的颗粒细胞也具有阳性信号，且其表达在孕中期及孕晚期均为强阳性[23]。Caspase-3在新生大鼠卵母细胞细胞核及其周围表达，在颗粒细胞中也能检测到阳性信号，而卵母细胞形成原始卵泡和初级卵泡的过程均未检测到阳性信号[24]。这些结果表明，Caspase-3在卵母细胞凋亡中扮演了重要角色。同样，在钝齿巨兔脂鲤(Leporinusobtusidens)滤泡闭锁晚期的滤泡细胞和膜细胞能检测到大量的Caspase-3阳性信号，而在闭锁早期信号较弱[7]。使用Caspase-3免疫组织化学染色法检测性逆转前后三斑海猪鱼卵母细胞凋亡发现，在雌性性腺的卵母细胞中未检测到明显的凋亡信号，但在性逆转早期的卵母细胞的细胞质和细胞核中均检测到阳性信号[8]。本研究中，从间性早期到间性晚期性腺中初级生长期卵母细胞细胞质均有阳性信号，表明初级生长期卵母细胞凋亡贯穿性逆转始终；间性早期和间性中期的皮质小泡期卵母细胞细胞核中有阳性信号，推测皮质小泡期卵母细胞凋亡主要发生在性逆转早期；卵黄生成期卵母细胞阳性信号位于细胞质，主要在卵黄生成中期和间性早期发生凋亡。Caspase-3阳性信号在皮质小泡期卵母细胞细胞核和颗粒细胞，而在细胞质中未见明显信号，这可能是由于皮质小泡期卵母细胞细胞质中迅速沉积和充塞的大量脂滴和卵黄物质使得细胞质中阳性信号变得不明显。此外，各个性腺发育时期的初级生长期卵母细胞的细胞质和细胞核均有表达，而在其滤泡细胞中未检测到明显的阳性信号，这可能和其滤泡细胞并未开始大量增殖和分化为颗粒细胞有关。刘修业等[25]研究结果也证实，幼小的卵母细胞退化方式与体积大的卵母细胞有所不同，退化完成的时间比体积大的卵母细胞要晚。而在本实验中，性逆转过程中首先消失的是体积较大的卵母细胞的信号，最后才是初级生长期卵母细胞消失，卵母细胞凋亡完成的时序与刘修业描述的卵母细胞凋亡顺序一致。黄鳝Caspase-3的这种表达模式与其它物种存在较大的差异，这可能与黄鳝为分批产卵方式和产卵后进入性腺性逆转过程的特性有密切关系。