Caspase-3在黄鳝性腺性逆转过程中的表达及定位分析

何 智，何治德，2，何 亮，阮会斌，李 松，严太明

(1.四川农业大学动物科技学院，成都 611130；2.泸州市农业农村局，四川 泸州 646000)

半胱氨酸蛋白酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)是Caspase家族中最重要的凋亡执行者[1]，活化后直接参与切割细胞多种结构蛋白和功能蛋白，引起细胞以凋亡的形式解体[2，3]。哺乳动物Caspase-3参与了滤泡细胞凋亡过程[4]，在凋亡中晚期表达量明显升高[5，6]。同样，鱼类卵母细胞凋亡过程也需要Caspase-3的参与[7]。三斑海猪鱼(Halichoerestrimaculatus)由雌性向雄性转变期卵母细胞中检测到Caspase-3的大量表达[8]。热应激诱导银汉鱼(AtherinableekeriGünther)卵母细胞凋亡过程中，Caspase-3活性与卵母细胞的凋亡具有明显的同步性[9]。

黄鳝(Monopterusalbus)隶属于合鳃鱼目(Synbgranchiformes)合鳃鱼科(Synbranchidae)黄鳝属(Monopterus)[10]，存在由雌性性腺向雄性性腺转变的天然性逆转现象。研究证实黄鳝性逆转过程伴随着性腺的凋亡[11]，但其凋亡具体机制目前尚不清楚。本研究通过克隆caspase-3的序列，检测其mRNA表达水平和蛋白相对含量的变化，并定位其在不同发育时期的卵母细胞的表达位置，探究Caspase-3与黄鳝性逆转的相关性，期望为揭示黄鳝性逆转机制提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用黄鳝购自于四川省成都市温江区瑞航农贸市场，分别于2017年1月—12月每月取样1次，每次取样60尾左右。挑选体质健康、不同规格的黄鳝于四川农业大学水产养殖系实验室暂养24 h后，进行不同发育时期性腺样本的收集。性腺组织一部分使用包恩氏液固定，用于发育时期鉴定和免疫组化定位；另一部分液氮速冻后，-80 ℃保存备用。

1.2 性腺发育时期鉴定和样本筛选

参照肖亚梅的报道[13-14]，采用石蜡组织切片进行性腺发育时期的鉴定，从采集的样本中挑选卵黄生成中期、间性早期、间性中期、间性晚期和雄性时期的性腺样本用于本实验。……