裙带菜多肽的制备及其抗氧化活性的研究

毕秋芸

(淄博职业学院，山东 淄博 255314)

随着人们对陆地资源的不断开发，人们可利用的资源越来越少，其中很多资源已面临枯竭的危险。而相比之下，海洋中蕴含的资源极其丰富，对海洋生物资源的开发利用至今仍是人类涉及不多的领域，所以海洋生物资源的开发潜力巨大。裙带菜属褐藻门、裙带菜属，是经济价值很高的大型褐藻，蛋白质含量较高，约占藻体的16%左右，仅次于龙须菜和紫菜[1]，是我国北方大规模栽培的主要藻类。但目前，我国对裙带菜的开发主要以提取海藻酸钠和碘为主，利用率仅达30%左右，大部分裙带菜蛋白成了加工废弃物，未得到有效利用[2]，造成了资源的极大浪费。近年来，随着对海洋资源的不断开发，海藻抗氧化肽迅速成为国内外专家学者研究的热点，部分学者已从海藻中分离得到多种可清除体内自由基、具有抗氧化作用的海藻活性肽[3]，显示了海藻类蛋白能够作为水溶性抗氧化剂的新资源，但对裙带菜蛋白酶解制备抗氧化肽的研究还相对较少，仅有于慧等在2017年探究了响应面试验优化裙带菜蛋白酶解工艺，并研究了酶解产物的抗氧化活性，显示裙带菜多肽具有较强的亚铁离子螯合能力[4]。本实验利用多种蛋白酶水解裙带菜蛋白，在酶解单因素试验基础上，运用正交试验法对水解工艺条件进行了优化，得到裙带菜多肽的最佳制备条件。并对酶解后的裙带菜多肽进行了超滤分级，研究分级后不同分子量段的裙带菜多肽的抗氧化活性，为裙带菜的深加工提供了一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜裙带：购于海货市场，洗净晒干后，用组织粉碎机粉碎，包装密封，于阴凉干燥处保存。

复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶：丹麦诺维信有限公司；碱性蛋白酶、胃蛋白酶：杰能科(中国)生物工程有限公司；DPPH、菲洛嗪：美国Sigma公司；抗坏血酸、三氯乙酸、三氯化铁、铁氰化钾、无水乙醇等：均为分析纯。

1.2 仪器和设备

1.3 实验方法

1.3.1 裙带菜蛋白质的提取方法

将裙带菜洗净、去杂，50 ℃恒温烘干粉碎，过60目筛，加入一定量的石油醚脱脂2次，每次6 h，脱脂后于50 ℃烘干恒重。称取一定量的脱脂粉末，放入圆底烧瓶，按照液料比23∶1的比例加入质量分数2.2%的氢氧化钠溶液在55 ℃的温度条件下提取5 h后过滤，向滤液中加入盐酸调节pH至5.0，在4000 r/min条件下离心20 min，得沉淀，冷冻干燥后即为裙带菜蛋白。

1.3.2 裙带菜多肽的制备方法

一定量的裙带菜蛋白质→加缓冲溶液→调节至酶解条件→酶解→85 ℃灭酶15 min→5000 r/min离心20 min→取上清液→冷冻干燥→裙带菜多肽。

1.3.3 还原力的测定

取一定量的裙带菜多肽，加入3.5 mL 0.2 mol/L的磷酸缓冲液(pH 6.6)、2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液，混匀后于50 ℃水浴保温30 min，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，混匀后于3000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，混匀，静置10 min后，于波长700 nm处测定其吸光度，记为酶解液的还原力。吸光度越大，表示还原能力越强[5]。

1.3.4 裙带菜多肽超滤分级

取一定量的裙带菜蛋白质溶于水中，调节体系pH至7.0，沉淀未反应的蛋白，经4000 r/min离心。在室温条件下，使用Pellicon-2超滤装置对上清液进行超滤分离，进行多步分级(截留分子量Mw>10 kDa，5～10 kDa，3～5 kDa，1～3 kDa，<1 kDa)。

1.3.5 裙带菜多肽清除DPPH自由基能力和亚铁离子螯合能力的测定

配制一定浓度的裙带菜多肽液，按照于慧等的方法进行测定。

1.3.6 裙带菜多肽·OH清除能力和O2-·清除能力的测定

配制一定浓度的裙带菜多肽液，按照齐希光等的方法进行测定[6]。

1.3.7 裙带菜多肽分子量分布的测定

裙带菜多肽的分子量测定方法及条件设置参照张友维[7]的方法。

1.3.8 裙带菜多肽氨基酸组成的测定

裙带菜多肽的氨基酸组成测定，以外标法于安捷伦AG1100型氨基酸专用液相色谱仪进行定量分析，具体样品预处理和测定方法参照郭旭[8]的方法。

2 结果与分析

2.1 裙带菜蛋白质组分分析

表1 裙带菜蛋白质组成成分分析Table 1 The composition analysis of Undaria pinnatifida protein g/100 g

由表1可知，干裙带菜中的主要成分为蛋白质和多糖，其中蛋白质的含量为12.11 g/100 g，多糖的含量为38.27 g/100 g。经过本实验提取后的裙带菜蛋白的纯度可达到83.21 g/100 g。

2.2 裙带菜蛋白质酶解单因素试验

2.2.1 蛋白酶种类及酶解时间对裙带菜多肽抗氧化活性的影响

按照一定的料液比和加酶量，分别加入木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶，分别于各自的最适酶解条件下，酶解1，2，3，4，5，6 h后，于85 ℃灭酶15 min，离心后取其上清液，冷冻干燥，测定其总还原力。

由图1可知，随着酶解时间的不断延长，5种酶酶解制备的裙带菜多肽的总还原力呈现先增加后逐渐降低的趋势。碱性蛋白酶酶解制备的裙带菜多肽的总还原力明显高于其他4种酶。其中木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解制备的裙带菜多肽的还原力相对较弱，复合蛋白酶和胃蛋白酶酶解制备的裙带菜多肽的还原力处于5种酶的中等水平，碱性蛋白酶酶解制备的裙带菜多肽的还原力最强。其中碱性蛋白酶酶解3 h后制备的裙带菜多肽的总还原力最高，吸光值达到0.321。因此，选择碱性蛋白酶作为单因素试验的最佳酶解用酶，3 h为最佳酶解时间。

图1 酶种类及酶解时间对裙带菜多肽还原能力的影响Fig.1 The influence of enzyme types and enzymatic hydrolysis time on reduction ability of Undaria pinnatifida peptides

2.2.2 料液比对裙带菜多肽抗氧化活性的影响

选择碱性蛋白酶，按照1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的料液比，按照一定的加酶量，在碱性蛋白酶理论最适pH值和温度条件下水浴反应3 h，制备裙带菜多肽，并测定其总还原力。

图2 料液比对裙带菜多肽还原能力的影响Fig.2 The influence of solid-to-liquid ratio on reduction ability of Undaria pinnatifida peptides

由图2可知，料液比在1%～4%范围内，随着料液比的不断增大，裙带菜多肽的还原力不断增强，当料液比高于4%时，随着浓度的增加，裙带菜多肽的还原力趋于平稳。这是因为料液比较低的情况下，底物浓度不足，酶解制备的具有还原能力的裙带菜多肽的含量较低，此时，随着料液比的不断增加，酶解制备的裙带菜多肽的还原能力不断提高。当料液比达到4%时，底物浓度充足，碱性蛋白酶不足，因此，此时增加料液比，不能提高制备的裙带菜多肽的还原能力。因此，选择4%的料液比作为酶解反应单因素试验的最佳料液比。

2.2.3 加酶量对裙带菜多肽抗氧化活性的影响

选择碱性蛋白酶，在料液比4%的条件下，按照1000，3000，5000，7000，9000，11000，13000 U/g的加酶量加入碱性蛋白酶，在碱性蛋白酶理论最适pH值和温度条件下，振荡水浴中反应3 h，制备裙带菜多肽，并测定其总还原力。

图3 加酶量对裙带菜多肽还原能力的影响Fig.3 The influence of enzyme amount on reduction ability of Undaria pinnatifida peptides

由图3可知，加酶量对裙带菜多肽总还原力的影响较大，随着加酶量的不断增加，制备的裙带菜多肽的总还原力呈现先增加后逐渐稳定的趋势。当碱性蛋白酶的加酶量为1000 U/g时，制备的裙带菜多肽的总还原力最低，吸光值为0.216。当加酶量增加至7000 U/g时，裙带菜多肽的还原力基本达到最高，此时的吸光值为0.362。继续提高加酶量，对制备的裙带菜多肽的总还原力影响不大。这是因为在1000～7000 U/g的加酶量范围内，底物浓度充足，碱性蛋白酶含量不足，酶解后产生的抗氧化性多肽较少，随着加酶量的不断增加，酶解后产生的抗氧化活性肽逐渐增加，制备裙带菜多肽的总还原力不断提高。而酶用量增大到一定量时，酶分子间碰撞的机会增加，会引起酶自溶，不利于酶促反应的进行[9]，因此，选择7000 U/g作为酶解反应单因素试验的最佳加酶量。

2.2.4 pH对裙带菜多肽抗氧化活性的影响

选择碱性蛋白酶，在加酶量7000 U/g、料液比4%的条件下，按照不同pH值(8.5，9，9.5，10，10.5，11，11.5)，在碱性蛋白酶理论最适温度下振荡水浴反应3 h，制备裙带菜多肽，并测定其总还原力。

图4 pH对裙带菜多肽还原能力的影响Fig.4 The influence of pH on reduction ability of Undaria pinnatifida peptides

由图4可知，随着体系pH的逐渐增大，制备的裙带菜多肽的总还原力呈现先增加后降低的趋势。这是因为碱性蛋白酶对体系的pH变化敏感，不同pH下结构会发生一定的变化，酶切活性随之不同[10]。当pH为8.5时，碱性蛋白酶的活力较低，酶解后产生的裙带菜多肽的抗氧化活性最低，吸光值仅为0.265。随着pH的逐渐升高，碱性蛋白酶的酶活逐渐增加，另外，裙带菜蛋白质的结构在碱性条件下逐渐打开，蛋白质结构变得更加松散，蛋白酶更容易于酶切位点结合，对酶解作用有利，使得酶解更加充分，进而增加了制备后的多肽的总还原力，当pH为10.0时还原力达到最大值，此时吸光值为0.381。当pH高于10.0时，体系pH过高，碱性蛋白酶活性降低，进而导致制备后的多肽的总还原力降低。因此，选择pH 10.0为单因素试验的最佳pH值。

2.2.5 温度对裙带菜多肽抗氧化活性的影响

裙带菜蛋白在加酶量为7000 U/g、料液比为4%、pH为10.0的条件下，分别在40，45，50，55，60，65，70 ℃振荡水浴酶解3 h，制备裙带菜多肽，并测定其总还原力。

由图5可知，在一定温度范围内，随着酶解温度的升高，裙带菜多肽的还原能力呈现先升高后降低的趋势，当酶解温度为55 ℃时，制备后的裙带菜多肽的还原力达到最大值，此时吸光值为0.396。当酶解温度超过55 ℃时，裙带菜多肽的抗氧化活性呈下降趋势。可见，在酶解过程中，适当提高温度可增加酶的活力，促进抗氧化肽的产生，但若温度过高，酶蛋白变性，酶的稳定性下降，酶解效率也随之降低。因此，裙带菜蛋白的酶解温度以55 ℃为宜。

图5 温度对裙带菜多肽还原能力的影响Fig.5 The influence of enzymolysis temperature on reduction ability of Undaria pinnatifida peptides

2.3 裙带菜蛋白质酶解正交试验

在单因素试验的基础上，以裙带菜多肽的总还原力为指标，在固定料液比为4%的条件下，以酶解时间、酶解温度、加酶量及pH为因素，通过四因素三水平的正交试验对酶解条件进行优化，见表2。

表2 正交试验因素水平表Table 2 The factors and levels of orthogonal test

表3 正交结果分析Table 3 The results of orthogonal test

由表3极差R1可知，影响裙带菜多肽总还原力的各因素主次顺序为A>D>C>B。因此，酶解温度对裙带菜多肽还原力的影响最大。根据各试验因子的平均数可知，在所选的因素水平下，水解最佳组合为A2B3C3D2。

按照正交试验优化的酶解条件：酶解温度55 ℃、酶解时间3.5 h、加酶量7500 U/g、pH 10.0条件下，分别进行3次裙带菜蛋白酶解试验，制备裙带菜多肽，并测定其总还原力，平均吸光值为0.411。

2.4 裙带菜多肽的超滤分级

2.4.1 裙带菜多肽组成成分分析

表4 裙带菜多肽成分分析Table 4 Analysis of polypeptide components of Undaria pinnatifida g/100 g

由表4可知，经最优条件酶解制备的裙带菜多肽的组分为多肽含量72.5 g/100 g，多糖含量0.34 g/100 g，灰分含量26.79 g/100 g，其他0.37 g/100 g。

2.4.2 裙带菜多肽分子量分布分析

酶解制备的裙带菜多肽的分子量分布见图6。

图6 裙带菜多肽的平均分子量分布Fig.6 The average molecular weight distribution of Undaria pinnatifida polypeptides

由图6可知，裙带菜多肽主要是由低分子量的肽段组成，其中低于1 kDa分子量肽段部分占总峰面积的77.63%。

2.4.3 不同分子量裙带菜多肽的氨基酸组成

将裙带菜多肽进行超滤分级，依照截留孔径的大小，裙带菜多肽可分成5个组分，分子量大小如下：UPPs-L(Mw<1 kDa)、UPPs-1(Mw=1～3 kDa)、UPPs-3(Mw=3～5 kDa)、UPPs-5(Mw=5～10 kDa)、UPPs-10(Mw>10 kDa)，对超滤后的5个裙带菜多肽组分进行氨基酸分析，结果见表5。

表5 各组分氨基酸分析Table 5 Amino acid analysis of each component

续 表

不同分子量肽段中氨基酸种类与组成的不同，在一定程度上影响了裙带菜多肽抗氧化活性的大小。如含硫氨基酸Cys和Met，含咪唑基的氨基酸His等，因具有亲核性可作为氢受体，提高肽段的抗氧化活性。芳香族氨基酸可以参与供氢，减慢或终止自由基链式反应，提高肽段的抗氧化活性，Glu可以作为氢供体提高肽类物质的还原能力等[11]。因此，分析不同分子量裙带菜多肽的氨基酸组成，对分析其抗氧化性具有重要的意义。由表5可知，不同分子量的裙带菜多肽中的氨基酸组成不同，其中UPPs-L中疏水性氨基酸含量达到44.41 g/100 g，对多肽片段的抗氧化性有利，其His含量占3.97 g/100 g，高于其他组分，由此可以推测该片段具有较强的抗氧化活性。

2.5 不同分子量裙带菜多肽的抗氧化活性测定

裙带菜多肽作为一种混合体系的酶解产物，其抗氧化性可能表现为多重反应机制，因此，本文从O2-·清除能力、·OH清除能力、DPPH自由基清除能力、Fe2+螯合能力4个方面来评价UPPs-L、UPPs-1、UPPs-3、UPPs-5、UPPs-10的抗氧化能力。

2.5.1 不同分子量裙带菜多肽清除O2-·的能力

图7 不同分子量段的裙带菜多肽对O2-·的清除能力Fig.7 O2-·scavenging capacity of UPPS with different molecular weights

由图7可知，不同分子量段的裙带菜多肽对O2-·的清除能力不同。其中UPPs-1(Mw=1～3 kDa)对O2-·的清除能力最强，清除率达到31.7%，UPPS-L(Mw<1 kDa)对O2-·的清除能力次之，清除率达到27.5%，UPPs-10(Mw>10 kDa)对O2-·的清除能力最弱，清除率仅达到11.6%。相关研究报道，酚羟基对O2-·有较强的清除能力，酚羟基的个数增加会提高O2-·的清除效果[12]。而酪氨酸(Tyr)具有酚羟基结构，能提高多肽的O2-·清除能力。UPPs-1肽段中酪氨酸含量为6.23 g/100 g，远高于其他组分，在一定程度上提高了UPPs-1的O2-·清除活性。

2.5.2 不同分子量裙带菜多肽清除·OH的能力

Fe2+可与邻菲罗啉(phen)生成橙红色配合物[Fe(phen)3]2+，H2O2在Fe2+的催化下产生具有强氧化性的·OH，使得Fe2+氧化成Fe3+，继而生成无色或蓝色的配合物[Fe(phen)3]3+，原本的溶液褪色。在多肽、氨基酸的存在下，氨基酸等物质易与·OH发生氧化修饰，捕捉·OH，从而延缓溶液的褪色变化，因此可以表征多肽体系的抗氧化性。

图8 不同分子量段的裙带菜多肽对·OH的清除能力Fig.8·OH scavenging capacity of UPPS with different molecular weights

由图8可知，UPPs-L和UPPs-1具有较好的·OH清除效果，清除率分别可以达到21.85%和16.43%，而UPPs-3、UPPs-5、UPPs-10 3个分子量段的裙带菜多肽的·OH清除能力较弱。

2.5.3 不同分子量裙带菜多肽清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基清除率是快速定量分析多肽作为电子受体、转移电子能力的通用方法[13]。由图9可知，不同分子量段的裙带菜多肽对DPPH自由基的清除能力不同，其中低分子量段的UPPs-L、UPPs-1和高分子量段的UPPs-10的清除率较高，分别为58.35%、43.48%和40.29%。中分子量段的UPPs-3和UPPs-5的清除率较低且差别不大，仅为25.62%和22.16%。这是因为高分子量的裙带菜多肽片段中具有较多电子致密的侧链基团，疏水性较强，更易于与DPPH·结合。而较低分子量片段的裙带菜多肽自身的空间位阻较小，电子转移能力较好，故而导致了2种分子量的裙带菜多肽的DPPH自由基清除率较高，这与Bamdad等[14]报道的DPPH自由基的清除率取决于良好的疏水性与在反应介质中的良好扩散性相一致。

图9 不同分子量段的裙带菜多肽对DPPH自由基的清除能力Fig.9 DPPH·scavenging capacity of UPPS with different molecular weights

2.5.4 不同分子量裙带菜多肽螯合Fe2+的能力

图10 不同分子量段的裙带菜多肽对Fe2+的螯合能力Fig.10 Fe2+ chelating capacity of UPPS with different molecular weights

Fe2+因高效的催化活性，加速自由基的生成，从而引发氧化性的链式反应。由图10可知，不同分子量片段的裙带菜多肽对Fe2+的螯合能力明显不同，其中UPPs-L的Fe2+螯合能力最强，螯合率达89.87%，UPPs-3次之，Fe2+的螯合率达82.14%，UPPs-10的Fe2+螯合能力最弱，螯合率仅为47.6%。据文献报道，肽段中苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸的存在，使得肽段容易形成类聚脯氨酸的螺旋结构，提高肽段的金属螯合能力[15]，这一结果与UPPs-3氨基酸分析结果一致，UPPs-3中的苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸组成含量达25.45%，明显高于其他组分，因此使得UPPs-3呈现出较高的Fe2+螯合能力。随着肽段的分子量不断变小，更多的带电活性小肽暴露出来，空间位阻减小，更易于与金属离子发生化学螯合，从而使得UPPs-L表现出极高的螯合能力。

3 结论

本研究以多肽的还原能力为指标，通过酶解的单因素和正交试验确定了碱性蛋白酶为裙带菜抗氧化肽制备的最佳酶，最优酶解条件为：料液比4%、酶解温度55 ℃、酶解时间3.5 h、加酶量7500 U/g、pH 10.0，此时裙带菜多肽的还原能力最强，在700 nm处的吸光值为0.411，并对裙带菜多肽进行超滤分级，从O2-·清除能力、·OH清除能力、DPPH自由基清除能力、Fe2+螯合能力4个方面，探究不同分子量段的裙带菜多肽的抗氧化能力。结果表明：裙带菜多肽在Fe2+螯合能力和DPPH自由基清除能力方面较强，在O2-·清除能力和·OH清除能力方面相对较弱。且总体呈现低分子量的裙带菜多肽的抗氧化活性较强，高分子量的裙带菜多肽的抗氧化活性较弱的趋势。其中，UPPs-L(Mw<1 kDa)的Fe2+螯合能力、DPPH自由基清除能力和·OH清除能力最强，螯合率和清除率分别达到89.87%、58.35%和21.85%，UPPs-1(Mw=1～3 kDa)的O2-·清除能力最强，清除率达到31.7%，UPPs-5(Mw=5～10 kDa)和UPPs-10(Mw>10 kDa)的抗氧化能力均相对较弱。