核酸检测技术在无偿献血者血液筛查中的应用

陶刚 李晓燕

[摘要] 目的 分析探讨核酸技术在无偿献血者血液筛查中应用的必要性。方法 方便选取该血站2017年6月—2018年6月共20 000人份标本进行研究，样本检验采用ELISA（酶联免疫吸附实验）法，对于ELISA单项阴性的标本再进行核酸检测，观察无偿献血者HbsAg、抗-HCV、抗-HIV检测的阳性率从而评价核酸检测的价值。结果 经过血清学ELISA检测共260份阳性样本（1.31%），ELISA检测阴性的标本经过核酸检测有20例阳性（0.10%）。结论 通过核酸检测发现血清学ELISA检测合格的血液仍旧存在输血传播疾病的风险，主要是HBV（乙型肝炎），因此核酸检测技术在献血者血液筛查中的应用能够最大程度的防止输血疾病的传播，血液筛查的质量明显提升，提高了献血的安全性。

[关键词] 无偿献血；血液筛查；核酸检测；应用

[中图分类号] R19 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2019）01（b）-0183-03

[Abstract] Objective To analyze the necessity of application of nucleic acid technology in blood screening of unpaid blood donors. Methods A total of 20，000 specimens from June 2017 to June 2018 were convenient selected for the study. Samples were tested by ELISA （enzyme-linked immunosorbent assay）. Nucleic acid detection was performed on ELISA single negative samples to observe unpaid blood donors. The positive rate of HbsAg， anti-HCV， and anti-HIV detection thus evaluates the value of nucleic acid detection. Results A total of 260 positive samples （1.31%） were detected by serological ELISA. The negative samples by ELISA were positive for 20 cases（0.10%） after nucleic acid detection. Conclusion The risk of transfusion-transmitted diseases is still found in the blood of serological ELISA test by nucleic acid test， mainly HBV （hepatitis B）. Therefore， the application of nucleic acid detection technology in blood screening of blood donors can prevent blood transfusion diseases to the greatest extent spreading， the quality of blood screening is significantly improved， and the safety of blood donation is improved.

[Key words] Unpaid blood donation； Blood screening； Nucleic acid detection； Application

臨床中预防和控制输血相关的传染病非常重要，现在我国供血机构病毒血清学检测模式为HbsAg、抗-HCV、抗-HIV联合ELISA检测，这种标志物间接检测虽然极大地降低了输血疾病传播的风险，但是有较长的“窗口期”， 从感染病原开始至能够某种检测方法检测到该病原存在的一段时间为“窗口期”[1-2]。试剂越来越优化最大限度的缩短了“窗口期”仍存在免疫沉默性感染、病毒滴度、变异，输血传染病时有发生[3]。NAT为病毒核酸扩增技术，现在不少发达国家将NAT运用在献血者血液筛查中，国内少数血站初步应用，为了进一步分析NAT在血液筛查中的必要性，方便选取该站20 000份样本进行研究的具体报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

方便选取该血站共20 000人份标本进行研究，所有无偿献血者均资源参与此次研究并且签署知情同意书，均符合《献血者健康检查的要求》[4]的相关标准。20 000名无偿献血者中11 242人为男性，8 758人为女性，年龄18～50岁，平均（25.32±5.34）岁。采血需要使用3支EDTA抗凝管，血量5 mL，1600 r/min低温离心15 min，放置2～8℃冰箱留样，3支试管中2支带分离胶，其中1支需要无热源、无酶。分离血浆需要在24 h内，48 h后血清学筛查只能用不带分离胶的试管内样本，NAT检测使用带分离胶、无酶、无热源的留样试管，另外一管进行标本保存。

1.2 方法

所有血液样本检验采用两种试剂进行ELISA法检测，任何一种试剂有反应都需要进行双孔复查，对于其中任何一孔有反应均判定为不合格。留取标本当天进行ELISA检测，第2天待查标本进行核酸检测，所有操作均在生物安全柜内进行。对于ELISA单项阴性的标本再进行核酸检测，1份0.96 mL混样池由6份原始样本各160 μL汇集成，混样不足6份的由加样系统自动补足0.96 mL，对混样池进行核酸提取，聚合酶链式反应45个循环。所有操作均按照SOP操作规程进行，核酸检测技术结果报告：阴性结果混样池的所有标本报阴性结果，结果有反应性混样池需要进行拆分检测（原始样本0.96 mL单样本检测），拆分的单样本检测有反应报阳性结果。

ELISA检测试剂：HbsAg试剂生产厂家为北京万泰生物药业股份有限公司和厦门新创，抗-HCV生厂厂家为北京万泰和厦门新创，抗-HIV试剂生厂厂家为厦门新创和法国伯乐。所有试剂均为合格产品，通过国家食品药品监督管理部门批准，使用严格遵循SOP的操作规程。核酸检测试剂：华益美生产的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1型）核酸检测试剂盒，采用PCR-荧光法使用仪器：全自动酶免分析仪、全自动酶免加样仪（Tecan），全自动核酸提取仪（华益美），全自动扩增分析仪（华益美）。

1.3 观察指标

观察无偿献血者HbsAg、抗-HCV、抗-HIV检测的阳性率并进行分析，评价核酸检测的价值。

1.4 统计方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析，正态计量资料用（x±s）表示，组间比较采用t检验，样本率的比较采用χ2检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 所有标本血清学ELISA检测的结果

经过血清学ELISA检测共260份阴性标本（1.31%），结果见表1。

2.2 所有標本中血清学ELISA阴性样本核酸检测结果

ELISA检测阳性的标本经过核酸检测有20份阳性（10.10%），见表2。

3 讨论

《血站技术操作规程》（2012版）规定将HBV、HCV、HIV核酸检测方法纳入到经血传播感染的检测方法常规模式中，血液筛查中的核酸检测技术主要包括两种，一种为TMA，另一种为Taqman PCR技术[5]。TMA应用较为广泛，无偿献血者采用单人份核酸检测技术后分析的灵敏度明显提升，技术较为成熟和客观。联检试剂HBV DNA达10.0 IU/mL，HCV RNA达3.0 IU/mL，HIV-1 RNA达45.0 IU/mL；鉴别试剂d-HBV达8.5 IU/mL，d-HCV达3.2 IU/mL，d-HIV-1达50.0 IU/mL[6]。

90年代，欧美一些发达国家开始在献血人群中使用核酸检测技术对HBV、HCV和HIV进行筛查，证明了可以有效降低血液疾病传播的风险，安全性较好[7]。但不同地区病毒流行率差异较为明显，可受多种因素影响如检测标本数量差异、ELISA试剂选择差异、核酸检测技术试剂或设备差异等[8]。通过此次研究得出结果：经过血清学ELISA检测共260份阳性样本（1.31%），ELISA检测阴性的标本经过核酸检测有20例阳性（0.10%）。所采用的的核酸检测技术筛查系统具有较高的林敏性，但是混合性样品检测的模式降低了系统本身的灵敏度导致核酸检测技术筛查系统灵敏度高于混合检测核酸检测技术筛查系统灵敏度[9]。原因可能为核酸检测技术可能存在较高假阳性概率，也可能在取样方面存在误差[10]。核酸联检和鉴别试剂具有较高灵敏度，单项检测的阳性标本病毒分布不规则，在载量方面有缺陷，所有可能每次取量不同影响检测的结果[11]。通过研究发现，HbsAg血液筛查之后仍然存在传播的主要因素是OBI（隐匿性乙型肝炎病毒）的献血者的存在，OBI病毒无法有效检出HbsAg但在核酸检测技术中会呈现阳性，说明输血的风险是发生OBI[12]。实际工作中ALT是无偿献血者献血前的基本筛查项目，一般ALT不合格标本会进行报废处理，其异常结果的原因不一定是HCV和HBV感染，也可能由其他病理性原因引起，因此实效性不理想[13]。

血清学的抗原抗体检测具有较长的窗口期，ELISA试剂检测HbsAg的“窗口期”为56 d，抗-HCV为82天，抗-HIV为22 d，而NAT检测HBV的“窗口期”缩短至25 d，HCV为59 d，HIV为11 d，明显缩短了病毒的窗口期，有效检测出ELISA漏检的病毒早期感染的标本[14]。我国是HBV感染概率较高的地区，虽然酶免试剂质量提高降低了输血后感染疾病的风险，但是ELISA“窗口期”的漏检仍旧为影响血液安全性的关键，ELISA阴性的血液仍旧有可能漏检导致输血安全隐患，因此引进NAT检测确保输血安全非常必要[15]。NAT技术是新型的输血传播传染病因子的筛查方法，研究表明NAT可有效提升输血安全系数，其反复性和灵敏度较为理想，WHO核酸检测标准稀释之后HCV、HIV检测结果显示以100%标准检出50 IU/mLHCV和50 IU/mLHIV-1的核酸，混合检测单份血液检测的灵敏度达到了95%。同时病毒核酸在血液标本的采集、储存、运输、检测过程中不会降解，需要在4 h内分离血浆、2～8℃保存、72 h内完成检测，若特殊情况无法完成检测需要在-20℃环境下冻存，但是一份样本仅可以进行一次冻融，说明外界因素不会影响检测的结果。在规范性操作和实验室质量管理标准中核酸检测技术达到了临床检验技术的相关标准。国内的研究机构做了一些血液残余风险评估发现NAT筛查得到的HBV结果各地不一，仍旧需要更多的数据积累，需要扩大标本检测数量，为核酸检测技术提供量化的、科学的证据。

综上所述，通过核酸检测发现血清学ELISA检测合格的血液仍旧存在输血传播疾病的风险，主要是HBV，因此核酸技术在献血者血液筛查中的应用能够最大程度的防止输血疾病的传播，血液筛查的质量明显提升，提高了输血的安全性。

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（收稿日期：2018-10-19）