紫草中紫草素及衍生物的分离研究

陈江龙

【摘 要】本文紫草中紫草素及衍生物的分离研究中运用硅胶柱层析法进行分离，采用了300-400目硅胶填充料，设置4cm×27cm的层析柱径高比，萃取出石油醚液提，进行浓缩，将硅胶混匀，得到石油醚与乙酸乙醋的洗脱溶剂，采用3.255ml/min的流速，分段将其流出分析。运用高效液相色谱法，得出紫草素及其中的5种衍生物，分别是紫草素、异戊酞紫草素、乙酞紫草素、β-轻基异戊酞紫草素等四种化合物。

【关键词】紫草中紫草素；衍生物；分离研究

紫草中主要生物活性成分有蔡酿类化合物，包括β-乙酞氧基异戊酞紫草素、紫草素、乙酞紫草素、β-β二甲基丙烯酞紫草素、异戊酞紫草素等，紫草具有良好的增强免疫力、抗炎、抗癌、降血糖、护肝、抗菌、抗生育等多多种功效。属于一种天然食用色素，紫草素类化合物能够有效抑制血小板活化因子、骨胶原、兔血小板凝聚、花生四烯酸等。单菇苯醒与单菇苯酚能够有效抑制体外前列腺的生物合成，属于我国传统的中药之一，对其进行人工种植培育以及衍生物的分离研究具有重要的应用前景。

一、实验

（一）实验材料与实验仪器

本次研究选用的是从黑龙江哈尔滨三棵树药材市场采购的新疆紫草药材，经过权威机构鉴定为属于新疆紫草的干燥根茎。实验试剂包括实验室自制的去离子水，中国药品生物制品检定所的紫草素对照品，以及甲醇与色谱纯。选用的实验仪器有美国Waters公司的Waters高效液相色谱仪，上海玻璃仪器厂的M-50型玻璃过滤器，北京Sartorious有限公司的BS210S电子天平，日本岛津公司的UV-2550紫外一可见分光光度计，江苏常熟长青仪器仪表厂的DT200A电子天平。

（二）实验方法

将甲醇加入到紫草素对照品之中制成0.4182mg/ml的溶液，以其作为对照品贮备液。将其加入到不同容量的溶液之中，加入甲醇进行定容，得出对照品的溶液。

制备样品溶液，选取10g干燥紫草根粉末，将100ml90%的乙醇溶液加入其中并进行3min的匀浆处理，之后使用漏斗进行抽滤处理，样本溶液即滤液，对样本溶液采用避光冷藏保存方式。测定提取液中紫草素含量，将1ml液计量体积进行稀释之后得出适宜的溶液，进行离心处理，采用的离心条件是25℃的离心温度，设置12000r/min的速度，进行5min的离心处理，对上清液进行3次检测，在55℃的温度环境下对剩余的溶液进行浓缩称重，计算其中的浸膏纯度。

选取10.0g绝干条件下的新疆紫草原料，对其进行超声、回流、微波、冷浸以及超临界CO2萃取，对液回收溶剂进行充分提取，在50℃环境将溶剂除去，计算样本中的得率与纯度。在提取时间增加的情况下，紫草素得率也在随之增加，同时起纯度也呈现出下降趋势，一般以3-5min的提取时间为宜。

二、紫草中紫草素及衍生物分离实验方法

（一）硅胶柱层析分离纯化紫草素衍生物

首先装柱，将300-400目硅胶在充分浸泡之下形成糊状，之后沿着层析柱壁逐层搅拌，设置1滴/秒的搅拌速度，确保将硅胶柱压实，并将其中的气泡赶尽，设置4cm×27cm的层析柱径高比。

之后上样，在60-90℃沸程下，以石油醚6次萃取1000ml紫草80%乙醇匀浆提取液，并将其合并成石油醚萃取液，在50℃的温度环境下，将溶液压缩至50ml，并将10g300-400目硅胶加入其中，在层析柱表面上将拌有紫草提取物的硅胶铺在其上，设置2cm的铺层厚度。

之后是洗脱处理，在一定的流速之下，将不同配比的溶剂体系进行洗脱处理，结合时间判断流处于的具体体积，并在固定的时间内对其进行HPLC检测，在石油醚：乙酸乙酷比例上设置一定的梯度进行洗脱处理，设置3.255ml/min的流速，分段将其流出分析。在流出紫草素衍生物时，将产品段进行充分收集，在HPLC检测下没有样本的情况下停止收集。并将收集到的紫草素衍生物洗脱液合并，并对其进行高效液相检测，之后对部分样品进行LC-MS检测。

（二）运用高效液相色谱一质谱联用仪

1.色谱设置条件

本次研究中采用高效液相色谱方法检测，即HPLC，将流动相：甲醇：水：乙酸之间的比例设置为82：17.5：0.5，设置5μm，4.6mm×250mm Kromasil C18的色谱柱，设置25℃的室温，设置1.0ml/min的柱温，设置10μL的进样量，以及516nm的检测波长。

2.采用结晶法纯化紫草素

对50ml紫草乙醇提取液，将其中的乙醇回收至剩余量的20ml，之后将20ml水加入至其中。之后以50ml为限萃取3次石油醚萃，并将三次萃取结果合并，计算三次的共同体积，之后萃取三次等体积的0.2mol/LNOH，并将1mol/L的H2SO4溶液加入其中，促进其反应直至溶液颜色从蓝色变成红色，其中的hH值变成5-6，在室温之下搅拌两小时，直至能够从溶液中析出红色固体物质，之后对溶液进行过滤、水洗，并在50℃的真空条件下干燥。选取其中一定量的样本进行溶解，对样本中所含有的紫草素含量进行测量。

三、实验结果

（一）采用硅胶柱层析分离纯化紫草素衍生物结果分析

采用硅胶柱层析法得到的紫草素及其衍生物中的色谱图具体如下图1所示。

图1 紫草素及其衍生物中的色谱图

按照色谱实施的条件对硅胶柱层析法中得出的紫草素及其蔡醒类衍生物单体进行色谱检测，分析各个不同单体成分中的分子量，并对色谱结果进行分析，能够得出化合物中的物Ⅰ表示紫草素，Ⅱ表示β、轻基异戊酞紫草素，Ⅲ表示乙酞紫草素，Ⅳ表示异戊酞紫草素，同时化合物中的Ⅳ与Ⅴ成分在此次试验结果下尚难以充分确定。

（二）结晶法纯化紫草素的结果

按照实验操作步骤，采用结晶法纯化紫草素，在此次实验中得到了15mg的红色紫草素固体，通过对其进行检测之后，得到90%以上的紫草素纯度。

四、结束语

本文运用硅胶柱层析法分离紫草素衍生物过程中设置了4cm×27cm的层析柱径高比采用了300-400目硅胶填充料，将石油醚萃取液提取出之后，对其进行一定浓缩，并将其与定量的硅胶充分混匀，之后得到不同不同体积比石油醚与乙酸乙醋的洗脱溶剂，设置3.255ml/min的流速，分段将其流出分析。在高效液相色谱法的运用之下，得出紫草素及其中的5种衍生物并对其采用液相-质谱检测，得出紫草素、异戊酞紫草素、乙酞紫草素、β-轻基异戊酞紫草素等四種化合物。

【参考文献】

[1]王升， 李璇， 蒋超，等. 紫草素及其衍生物合成相关基因及信号传导研究进展[J]. 中草药， 2012（6）：1219-1225.

[2]郝鹤， 叶和春， 王红. 一氧化氮对新疆紫草愈伤组织中紫草素及其衍生物合成的影响[J]. 中国科学院大学学报， 2014， 31（1）：46-53.

[3]刘玉梅. 高效液相色谱法同时测定紫草素及其衍生物[J]. 中国酿造， 2011， 30（1）：173-176.

[4]钟济华， 成玲剑， 周文，等. CCK法检测紫草素及衍生物对血液肿瘤细胞株的增殖抑制作用[J]. 中国实验诊断学， 2012， 16（8）：1366-1369.