拟南芥MYB4基因GUS载体构建及其转基因植株的筛选

欧阳剑 吴席 徐杰娜 樊婷婷

摘要[目的]进一步验证MYB4基因在响应干旱胁迫中的应答功能，构建ProMYB4：GUS载体，通过筛选鉴定获得相应的转基因植株。[方法]以野生型拟南芥植株的全基因组为模板，利用特异性引物扩增MYB4基因启动子，将目的基因连接到pART27载体上。然后将构建成功的重组载体转化至农杆菌GV3101，浸花法转化野生型植株。最后通过抗性筛选和PCR鉴定获得阳性转基因植株。[结果] MYB4启动子成功克隆，测序结果经过比对完全正确。抗性筛选获得了阳性转基因植株。[结论]成功获得ProMYB4：GUS阳性转基因植株，为进一步研究MYB4基因功能奠定了基础。

关键词拟南芥;MYB4基因;MYB4启动子;转基因植株

中图分类号Q939.9文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）03-0082-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.026

由于气候变化，干旱已经成为当今世界亟待解决的重大环境问题之一[1-2]。干旱对植物的生长发育有着巨大影响，会直接导致农作物产量急剧降低，严重影响人类的生存质量和经济发展[3-4]。探索抗旱相关基因的功能及其对干旱胁迫的响应机制具有重大的理论意义和实践价值[5]。寻找提高植物抗旱关键性基因并利用转基因技术对植物品种进行改良是解决上述问题的有效途径之一[6]。研究发现MYB4基因对植物抗旱起着关键性作用[7-8]。笔者拟通过克隆MYB4启动子，构建ProMYB4：GUS载体，从而进一步探究MYB4基因在拟南芥响应干旱胁迫中所起的作用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1材料。试验采用的植物材料为拟南芥（Arabidopsis thaliana），哥伦比亚背景（Columbia，Col），购于美国拟南芥种子资源中心，后经合肥工业大学植物分子生物学实验室繁殖所得。

1.1.2主要试剂及酶类。

Easy Taq DNA Polymerase（TransGen）;T4-DNA Ligase;PrimeSTAR HS DNA Ploymerase;限制性内切酶Kpn I （NEB）和Xho I （NEB）;无水乙醇，氯仿，蔗糖，Agar，NaCl，Yeast extract，Trypyone; DNA Loading buffer，Marker，Gold View，Silwet L-77，MES，壮观霉素，庆大霉素，卡那霉素等。

1.1.3菌体和质粒载体。大肠杆菌感受态细胞DH5α，农杆菌感受态菌株 GV3101，pART27 载体。

1.2方法

1.2.1拟南芥全基因组DNA的提取。

剪取单棵幼苗叶片（约 100 mg）于 1.5 mL EP 管中并加入2颗直径 3 mm 的玻璃珠，放入泡沫盒，倒入少量液氮，待液氮挥发后关盖上下剧烈摇动至植物组织完全破碎成均匀粉末;向破碎好的植株组织中加入已预热的 2×CTAB 缓冲液 600 μL，上下翻转混合均匀;65 ℃水浴锅，水浴加热30 min，期间每隔 10 min 轻轻弹动 EP 管;取出样品冷却到室温后放进塑料插板，加入配制好的酚氯仿混合试剂，上下剧烈摇晃约 15 s;室温 13 000 r/min 离心 10 min，吸取上清至新 1.5 mL EP 管中;加入 1 mL 无水乙醇，轻轻颠倒混匀后于-20 ℃冰箱沉淀1 h;室温 13 000 r/min 离心 10 min 后，弃上清，加入 1 mL 已配制好的 75%乙醇，室温 13 000 r/min 离心 3 min，再次弃上清。重复此步骤再次洗涤沉淀;彻底吸除上清，开盖倒置 EP 管室温干燥 20 min，待乙醇彻底挥发后向管中加入 40 μL 无菌双蒸水，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2MYB4基因启动子扩增。

利用Primer5.0软件设计所需引物，选用Kpn I和Xho I这2个酶切位点。上游引物FP：CGGGGTACCATAGTGAATGTGAAAAACTGAC;下游引物RP：CCGCTCGAGACTTTTATGTTTACTTTCTTTC，以获得的全基因组为模板进行基因扩增。

1.2.3重組质粒的获取。

将获得的启动子基因序列和pART27质粒采用限制性内切酶Kpn I和Xho I进行双酶切，利用T4-DNA Ligase连接，并将连接产物转入大肠杆菌感受态DH5α中，然后涂布于壮观霉素LB平板上。于37 ℃培养箱过夜培养，挑选单克隆菌落进行PCR鉴定，随后送测序。

1.2.4转基因植株的筛选。

将测序无误的重组质粒电击转化到农杆菌GV3101中，通过菌落PCR筛选鉴定阳性单克隆，挑取阳性单菌落培养，采用花序浸花法侵染野生型拟南芥植株。将所收种子干燥春化后撒于含50 μg/mL卡那霉素的1/2MS平板，置于光照培养箱培养10 d左右，挑选生长嫩绿且有根的幼苗进行移栽，后续筛选鉴定。

2结果与分析

2.1拟南芥MYB4基因启动子的克隆

选用野生型拟南芥幼苗叶片提取全基因组DNA，以此为模板，选取MYB4基因起始密码子ATG对MYB4启动子进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，电泳结果显示PCR所得片段约2 000 bp，说明MYB4启动子扩增成功。

2.3阳性重组质粒的PCR鉴定

将酶切后的目的基因及载体质粒利用T4-DNA  Ligase 酶进行连接，16 ℃连接过夜，然后将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，培养过夜后挑取单克隆菌落于加有相应抗性的液体培养基中振荡培养至菌液浑浊，然后进行菌落PCR，电泳检测结果见图3。将阳性菌株送测序，测序结果经过比对后，显示序列完全正确。

2.4阳性植株的筛选将测序正确重组质粒电转至农杆菌GV3101中，用含有壮观霉素和庆大霉素固体LB培养基筛选阳性克隆，挑选单菌落进行菌落PCR获取阳性克隆。然后对阳性克隆进行扩增培养，采用浸花法对花期野生型拟南芥进行侵染。收取侵染后的种子，春化14 d后撒于含有50 μg/mL卡那霉素的1/2MS平板上，置于光照培养箱培养10 d左右，挑选生长嫩绿且有根的幼苗进行移栽。卡那霉素筛选结果如图4所示。

3讨论

干旱、水資源缺乏是制约我国干旱地区经济社会发展和生态环境保护的关键因素[9]。据统计，我国约有1/3的土地处于干旱区，水资源缺乏制约了这些地区经济、社会发展和生态环境建设[10-11]。探索研究抗旱相关基因的功能及其对干旱胁迫响应的机制具有重大的理论意义和实践价值[12]。

致力于探索和研究植物抗旱关键性基因，并通过基因工程技术对植物品种进行优化和改良，是解决全球水资源匮乏问题的有效途径之一[13]。前期研究表明，MYB4基因参与植物对干旱胁迫的响应，通过基因工程技术构建ProMYB4：GUS重组载体，并通过生物学手段将其转入野生型拟南芥中，获得转基因植株，从而为进一步研究MYB4基因在植物中响应干旱胁迫时所起的作用奠定了基础。

参考文献

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