拟南芥CTSP3基因GUS载体构建及转基因植株的筛选鉴定

孟云 陶曼芝 吴席 曹树青 樊婷婷

摘要[目的]深入研究植物基因CTSP3的基因表达模式及其对重金属镉胁迫的响应机制，以野生型拟南芥为材料构建CTSP3-GUS重组质粒及GUS转基因植株。[方法]通过提取野生型拟南芥的DNA，克隆其启动区基因片段，将基因片段和pART27-GUS质粒双酶切后连接，转化到大肠杆菌感受态细胞中，菌落PCR和测序获得阳性单克隆。然后将CTSP3-GUS重组质粒转入农杆菌感受态GV3101，获得阳性单菌落。接着采用浸花法侵染野生型拟南芥，最后通过抗性筛选和PCR鉴定获取CTSP3-GUS转基因植株。[结果]成功克隆CTSP3启动区基因片段，构建出重组质粒，获得了CTSP3-GUS转基因植株。 [结论]获得CTSP3-GUS转基因植株，为接下来进一步研究该基因在植物响应镉胁迫机制中的功能奠定了基础。

关键词拟南芥;CTSP3;载体;转基因植株

中图分类号Q939.9文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）03-0084-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.027

重金属污染已经成为世界性重大环境问题之一，其中重金属镉污染尤为严重。过多的镉会对动植物细胞组织造成不可逆的损伤[1-3]。在重金属镉逆境中，植物通过控制金属流入、促进金属泵出、重金属螯合等途径来应激[4]。运用植物转基因技术对植物品种进行优化改良是解决重金属污染的最佳方式[5]。研究发现CTSP3功能缺失突变体对重金属镉胁迫表现出耐受的表型，所以笔者拟通过克隆CTSP3启动区基因，获得CTSP3-GUS植株，以进一步研究植物基因CTSP3的基因表达模式及其对重金属镉胁迫的响应机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1材料。植物材料是哥伦比亚（Columbia， col）遗传背景的拟南芥（Arabidopsis thaliana），从美国拟南芥种质资源中心获得，由合肥工业大学植物分子生物学实验室繁殖所得。载体构建所用质粒pART27-GUS，大肠杆菌DH5α，农杆菌GV3101。

1.1.2主要试剂及酶类。

Plasmid  miniprep Kit （TIANGEN），T4-DNA Ligase（NEB），PrimeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa），限制性内切酶Kpn Ⅰ（NEB），Hind Ⅲ（NEB），Easy Taq DNA Polymerase（TransGen），Agar， DNA loading buffer，异丙醇，氯仿，无水乙醇等。

1.2方法

1.2.1拟南芥无菌苗培养。

配制1/2MS固体培养基，取出存储于4 ℃冰箱的1/2MS培养基，按比例称取蔗糖琼脂和1/2MS，溶解调pH至5.8，封膜后高压蒸汽灭菌，灭菌结束后倒培养基至玻璃培养皿中。用0.1%氯化汞对种子杀菌消毒后，将种子均匀点在已凝固的培养基中。4 ℃冰箱中春化2 d，在恒温（22 ℃左右）培养室中光照竖直培养14 d，定期观察拟南芥生长情况。

1.2.2拟南芥DNA的提取。将培养皿中的拟南芥取出，放入研钵中，加650 μL已预热的CTAB，研磨至溶液状装入管中。65 ℃水浴45   min拿出静置到室温，加入650 μL酚氯彷剧烈混匀，离心吸取上清液，加900 μL无水乙醇，上下颠倒混匀，-20 ℃沉淀2 h。离心，弃上清后加75%乙醇，离心，弃上清，倒置使残留乙醇完全挥发。加入40 μL无菌水溶解DNA，获得DNA溶液。

1.2.3CTSP3启动区基因片段的克隆。

利用Oligo 7.0软件设计以下引物进行CTSP3启动区基因片段的克隆。上游引物为FP：5′-CGGGGTACCTCTTCAGTAGTAACGTTGCG-3′，下游引物为RP：5′-CCCAAGCTTTTCCTCTCTACCTTCTT-3′，以DNA为模板进行基因克隆。

1.2.4大肠杆菌的转化。

取出-80 ℃冰箱中存储的大肠杆菌DH5α感受态细胞，置于冰上解冻。解冻后，吸取10 μL质粒或连接产物加入到感受态细胞中，混匀，冰浴35  min，42 ℃水浴60 s，再冰上静置2 min。加600 μL无菌未加抗性的LB液体培养基，放在37 ℃摇床中低速振荡培养1～2 h。待菌液浑浊后，涂布于LB+壮观霉素的平板上。平板倒置放在37 ℃培养箱中培养过夜。

过夜培养后挑取培养皿单菌落，接种于LB+壮观霉素的液体培养基中，浑浊后PCR鉴定和测序。

1.2.5农杆菌的转化。

取出存储于冰箱中的农杆菌GV3101感受态细胞，解冻。取2 μL质粒加入到感受态细胞中，混匀，吸取至已预冷的0.1 cm电击杯中，电击后迅速加入600 μL无菌未加抗性的LB液体培养基，28 ℃摇床培养1～2 h至浑浊，涂布于LB+壮观霉素的平板上，28 ℃培养箱中培养2 d。培养皿上挑取单菌落接种于LB+壮观霉素的液体培养基中，28 ℃摇床培养浑浊，PCR鉴定。

1.2.6花序侵染法获取转基因拟南芥。

将阳性农杆菌接种于含壮观霉素的LB培养液中，振荡培养至OD600=1.2～1.4，离心去上清，用侵染緩冲液重悬至溶液OD600=0.8～1.2，最后加入一定量的SilwettL-77混匀，侵染花序，黑暗处理12 h。隔8 d，再次侵染。

1.2.7转基因阳性植株鉴定。

将获得的拟南芥种子置于含有卡那霉素的MS固体培养基中进行抗性筛选，培养箱培养7 d，将具有根且子叶颜色嫩绿的幼苗移栽至土质培养基中，提取DNA，经PCR鉴定正确后，即获得转基因阳性植株。

2結果与分析

2.1拟南芥CTSP3启动区基因片段的克隆

为了验证CTSP3基因在拟南芥镉耐受机理中的作用，构建CTSP3-GUS载体。以野生型拟南芥DNA为模板，通过PCR技术扩增CTSP3启动区基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，所选取启动区长度1 928 bp，与PCR所得片段大小一致。

2.2目的片段和质粒双酶切

基因扩增引物设计时，在上下游引物分别添加了限制性内切酶Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ的酶切位点保护碱基，使用限制性内切酶Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ对基因克隆获得CTSP3启动区基因片段和pART27-GUS质粒同时进行双酶切。酶切以后，电泳检测，酶切后的基因片段和载体质粒条带清晰，大小正确（图2）。

2.3连接和大肠杆菌转化后阳性克隆鉴定

T4连接酶将酶切后的基因片段与质粒片段连接，连接产物采取热击法导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，培养过夜后挑取单克隆菌落于加有相应抗性的液体培养基中振荡培养至菌液浑浊。

对上一步所得单克隆菌液PCR鉴定，所用引物为CTSP3启动区片段扩增引物，结果如图3所示。除了2号与5号菌落，其他菌落PCR条带与CTSP3启动区基因片段大小一致，说明其为阳性克隆。选取1号菌液进行测序，结果与CTSP3启动区序列完全吻合，说明成功构建CTSP3-GUS载体。

2.4农杆菌转化及花序浸染

将测序正确的CTSP3 -GUS重组质粒通过电击法转化入农杆菌GV3101，培养在庆大霉素和壮观霉素抗生素培养基，挑取单菌落PCR验证。电泳结果如图4所示，所选单克隆菌株均为阳性单菌落。

2.5CTSP3 -GUS转基因植株的抗性筛选

获取侵染后的拟南芥种子，37 ℃干燥，4 ℃春化后撒在含有卡那霉素抗性的MS平板上。恒温光照培养箱中培养7～10 d，长出来的小苗（具有长根，子叶颜色嫩绿）可能为转基因阳性植株，如图5所示。

2.6CTSP3 -GUS转基因阳性植株的鉴定

将筛选出阳性植株移载至土壤中，置于专用培养室中恒温光照培养，20 d后提取转基因植株DNA，进行鉴定。PCR鉴定结果如图6所示，筛选所得植株均为转基因阳性植株，即CTSP3-GUS转基因植株。

3讨论

土壤重金属污染是世界性的重大问题，镉作为基本矿物质元素[6]，通过矿物吸收机制进入细胞。土壤镉污染直接危害植物生长、动物和人类的健康[7]。目前，植物修复法是治理镉污染最有效的方法。

该试验自拟南芥种子资源中心获得CTSP3基因功能缺失型突变体[8-10]，前期研究结果显示CTSP3基因参与了植物对

镉胁迫的响应，因此通过基因工程技术构建CTSP3-GUS重组载体[11-12]，将其转入野生型拟南芥中，从而获得转基因植株。这为研究CTSP3基因在植物中的表达模式和镉耐受调节机制中的作用提供了依据，是一个非常关键的课题。

参考文献

[1] SHIM D， HWANG J U， LEE J，et al.Orthologs of the class A4 heat shock transcription factor HsfA4a confercadmium tolerance in wheat and rice[J].Plant cell，2009，21：4031-4043.

[2] TAMS L，MISTRK I，ALEMAYEHU I A.Low Cd concentrationactivated morphogenic defence responses are inhibited by high Cd concentration-induced toxic superoxide generation in barley root tip[J].Planta，2014，239（5）：1003-1013.

[3] CHEN F，WANG F，WU F B，et al.Modulationof exogenous glutathione in antioxidant defense system against Cd stress in the two barley genotypes differing in Cd tolerance[J].Plant Physiol Biochem，2014，48（8）：663-672.

[4] STRAIF K， BENBRAHIMTALLAA  L， BAAN  R，et al.A  review of human carcinogensPart C：Metal， arsenic， dusts， and fibres[J].Lancet  Oncol，2009，10（5）：453-454.

[5] KHNLENZ T，SCHMIDT H，URAGUCHI S，et al.Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase 2 is constitutively active in vivo and can rescue the growth defect of the PCS1deficient cad13 mutant on Cdcontaminated soil[J].J Exp Bot，2014，65（15）：4241-4253.

[6] HALL J L.Cellular mechanisms for heavy metal detoxificationandtolerance[J].J Exp Bot，2002，53：1-11.

[7] CLEMENS S.Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis[J].Planta，2001，212（4）：475-486.

[8] BELHAJ K， CHAPARROGARCIA A， KAMOUN S， et al.Plant genome editing made easy：Targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system [J].Plant methods， 2013， 9（1）：1-10.

[9] SIEMIANOWSKI O，BARABASZ A，KENDZIOREK M，et al.HMA4 expression in tobacco reduces Cd accumulation due to the induction of the apoplastic barrier[J].J Exp Bot，2014，65（4）：1125-1139.

[10] YAO J，KONG Q N，ZHU H Y，et al.Content and fractionation of Cu， Zn and Cd in size fractionated municipal solid waste incineration bottom ash[J]. Ecotox Environ Safe，2013，94：131-137.

[11] ZIENTARA  K，  WAWRZYN'SKA  A，UKOMSKA  J，et al.Activity of the AtMRP3 promoter in transgenic Arabidopsis thaliana and Nicotiana tabacum plants is increased by cadmium， nickel， arsenic， cobalt and lead but not by zinc and iron[J].J Biotechnol，2009，139（3）：258-263.

[12] ZHAI Z Y， GAYOMBA S R， JUNG H I，et  al.OPT3 is a phloemspecific  iron transporter that is essential for systemic iron signaling and redistribution of iron and cadmium in Arabidopsis[J].Plant cell，2014，26：2249-2264.