小秦艽花中总环烯醚萜和总酚酸的含量测定

杨倩 赵伟刚 王晓琴

摘要[目的]建立小秦艽花中总环烯醚萜和总酚酸含量测定的方法，并测定10个药材样品中的含量。[方法]分别以龙胆苦苷和没食子酸为对照品，建立紫外分光光度法测定总环烯醚萜和总酚酸含量的方法。[结果]10批小秦艽花样品中环烯醚萜含量为67.95～155.16 mg/g;总酚酸含量为9.54～17.04 mg/g。[结论]2种含量测定方法操作简便，精密度、重现性良好，结果准确可靠，可用于评价小秦艽花的质量以及资源利用价值。

关键词小秦艽花;总烯醚萜;总酚酸;含量测定

中图分类号R282.71文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）03-0183-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.057

小秦艽花，为龙胆科龙胆属植物达乌里龙胆（小秦艽）Gentiana dahurica Fisch.的干燥花[1]。2015版《中国药典》中将小秦艽与大叶秦艽（G.macrophylla Pall.）、粗茎秦艽（G.crassicaulis Duthie）、麻花秦艽（G.straminea Maxim）作为中药秦艽的基源植物，以干燥根入药[2]。秦艽始載于《神农本草经》，列为中品，性味苦、平，微寒，归胃、肝、胆经，具有祛风湿、清湿热、止痹痛、退虚热的功效。而在藏药志和蒙药志中，秦艽组植物多以干燥花入药，具有清热解毒、止咳祛痰的功效。秦艽花在藏药中应用普遍，有时会和小秦艽花混用。小秦艽花，蒙药名呼和-朱立根-其木格，是蒙医专属用药，用于肺热咳嗽、咽喉肿痛、毒热、瘟热等症[3]。

国内外学者的研究表明，秦艽基源植物的化学成分主要以环烯醚萜苷、三萜类和黄酮类为主。中药秦艽（达乌里龙胆的根）和全草的成分主要为环烯醚萜、三萜类、黄酮类和苯甲酸衍生物等[4-6]。在前期的研究中[7]，首次从小秦艽花中分离鉴定出40多个五环三萜类成分、环烯醚萜类、黄酮类和以没食子酸为代表的酚酸类成分，已经基本明确其主要次生代谢产物类型。另据文献报道[8]，以龙胆苦苷为代表的环烯醚萜类化合物具有一定的抗炎作用，可视为秦艽类药材抗炎的主要有效成分。目前以龙胆苦苷和没食子酸为对照品分别测定小秦艽花总环烯醚萜和总酚酸含量的方法均鲜见报道。笔者建立小秦艽花中总环烯醚萜和总酚酸的含量测定方法，为蒙药小秦艽花进一步的品质评价研究、规范化种植、临床应用和复方药物研发提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象。10批小秦艽花药材分别购买于河北安国药材公司、内蒙古蒙药材公司，或采集于内蒙古自治区，由内蒙古医科大学渠弼教授鉴定为达乌里龙胆（Gentiana dahurica Fisch.）的干燥花;该研究中含量测定方法学考察所用药材为1号样品（购买于内蒙古蒙药材公司）。

1.1.2主要仪器。 UVmini-1280型紫外可见分光光度计（日本岛津）;AL-204型分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）;超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.1.3主要试剂。龙胆苦苷对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号K16D7B26927，供含量测定用）;没食子酸对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号110831-200302，供含量测定用）。十二烷基硫酸钠、三氯化铁、铁氰化钾、盐酸和其他试剂均为分析纯;试验用水为蒸馏水。

1.2方法

1.2.1总环烯醚萜含量的测定方法。

1.2.1.1对照品溶液的制备。精密称取龙胆苦苷对照品5.20 mg置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成208 μg/mL的对照品溶液，贮藏于4 ℃冰箱备用。

1.2.1.2供试品溶液的制备。取小秦艽花药材粉末（3号筛）约0.1 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，称重，超声提取30 min，冷却至室温，补足失重，过滤，取续滤液0.15 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得供试品溶液。

1.2.1.3吸收波长的确定。分别精密量取供试品溶液0.3 mL，对照品溶液2 mL置于10 mL容量瓶中，甲醇溶液定容，摇匀。以甲醇溶液作为空白对照，于200～400 nm波长进行扫描[9]。

1.2.1.4线性关系的考察。精密吸取“1.2.1.1”项下龙胆苦苷对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，以甲醇作为空白对照，于271 nm处测定吸光度。以吸光度差值为纵坐标、浓度（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。

1.2.1.5精密度试验。 按“1.2.1.2”方法制备供试品溶液，并于271 nm处测定吸光度A，重复6次，计算峰面积的RSD。

1.2.1.6稳定性试验。 按“1.2.1.2”方法制备供试品溶液，分别于溶液制备后0、10、20、30、40、50、60 min测定吸光度，计算总环烯醚萜含量和RSD。

1.2.1.7重复性试验。 按“1.2.1.2”方法平行制备供试品溶液6份，于271 nm处测定吸光度，计算总环烯醚萜含量和RSD。

1.2.1.8加样回收率试验。取药材粉末9份，每份约0.05 g，精密称定，分别精密加入适量的龙胆苦苷对照品，按“1.2.1.2”方法制备供试品溶液，于271 nm处测定吸光度，计算平均回收率和RSD。

1.2.1.9样品总环烯醚萜的含量测定。10个批次小秦艽花按“1.2.1.2”方法制备供试品溶液，于271 nm处测定吸光度，平行测定3次，计算含量。

1.2.2总酚酸的含量测定方法。

1.2.2.1对照品溶液的制备。精密称取没食子酸对照品5.80 mg置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀后从中精密吸取1.0 mL溶液置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成23.2 μg/mL的没食子酸对照品溶液，贮藏于4 ℃冰箱备用。

1.2.2.2供试品溶液的制备。取小秦艽花药材（3号筛）粉末约0.1 g，精密称定，置于100 mL圆底烧瓶中，加入95%甲醇25 mL，加热回流2 h，冷却至室温，用95%甲醇补足减失重量，摇匀并过滤。

1.2.2.3顯色方法。精密吸取待测液适量于10 mL容量瓶中，加无水乙醇至2 mL，精密加0.3%十二烷基硫酸钠0.8 mL、0.6% FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）3]（1.0∶0.9）混合溶液0.4 mL，摇匀，在暗处放置5 min后用0.1 mol/L HCl定容，摇匀，暗处放置20 min[10]。

1.2.2.4吸收波长的确定。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各0.3 mL，显色后，以显色剂为空白，在200～800 nm波长进行扫描。

1.2.2.5标准曲线的绘制。精密吸取没食子酸对照品溶液0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mL，显色后，于743 nm处分别测定吸光度。以吸光度为纵坐标、浓度（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。

1.2.2.6精密度试验。按“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法制备供试品溶液并显色，于743 nm处分别测定吸光度A，重复测定6次，计算峰面积的RSD。

1.2.2.7稳定性试验。按“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法制备供试品溶液并显色，分别于显色后0、15、20、25、30、35、40、45、50、55 min 测定吸光度，计算总酚酸含量和RSD。

1.2.2.8重复性试验。取小秦艽花粉末6份，每份约0.1 g，精密称定，按“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法制备供试品溶液并显色，于743 nm处测定吸光度，计算总酚酸含量和RSD。

1.2.2.9加样回收率试验。取药材粉末9份，每份约0.05 g，精密称定，分别精密加入适量的没食子酸对照品，按照“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法制备供试品溶液并显色，于743 nm处测定吸光度，计算平均回收率和RSD。

1.2.2.10样品总酚酸的含量测定。10个批次小秦艽花按“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法制备供试品溶液并显色，于743 nm处测定吸光度，平行测定3次，计算含量。

2结果与分析

2.1总环烯醚萜含量的测定

2.1.1吸收波长的确定。按“1.2.1.3”方法操作，结果显示，对照品溶液与供试品溶液均在271 nm处有最大吸收，且无干扰，故选择271 nm作为测定波长。

2.1.2线性关系考察。按“1.2.1.4”方法操作，得到回归方程Y=0.018 2X-0.000 4（r= 0.999 0），表明龙胆苦苷在10.4～52.0 μg/mL与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.3精密度试验。按“1.2.1.5”方法操作， 计算得峰面积的RSD为0.08%，表明仪器精密度良好。

2.1.4稳定性试验。按“1.2.1.6”方法操作，计算得总环烯醚萜含量的RSD为0.40%，说明供试品溶液在60 min内稳定性良好。

2.1.5重复性试验。按“1.2.1.7”方法操作，计算得总环烯醚萜含量的RSD为0.60%，表明方法重复性良好。

2.1.6 加样回收率试验。按“1.2.1.8”方法操作，计算平均回收率为96.42%，RSD为1.88%，表明该含量测定方法准确可靠。

2.1.7样品总环烯醚萜的含量测定。由表1可知，10批小秦艽花样品中总环烯醚萜含量为67.95～155.16 mg/g。

2.2总酚酸含量的测定

2.2.1吸收波长的确定。按“1.2.2.4”方法操作，结果发现，供试品溶液与对照品溶液的吸收曲线基本一致，在743 nm处均有最大吸收波长，且无干扰，故选择743 nm作为测定波长。

2.2.2标准曲线的绘制。按“1.2.2.5”方法操作，计算得到回归方程Y=0.493 9 X+0.001 7（r=0.999 6），表明没食子酸在0.354～0.944 μg/mL与吸光度呈良好的线性关系。

2.2.3精密度试验。按“1.2.2.6”方法操作，计算得峰面积的RSD为0.04%，表明仪器精密度良好。

2.2.4稳定性试验。按“1.2.2.7”方法操作，计算得总酚酸含量在15～45 min的RSD为0.70%，说明供试品溶液在15～45 min稳定性良好。

2.2.5重复性试验。按“1.2.2.8”方法操作，计算得总酚酸含量的RSD为0.20%，表明方法的重复性良好。

2.2.6加样回收率试验。按“1.2.2.9”方法操作，计算得出平均回收率为98.19%，RSD为0.75%，表明该含量测定方法准确可靠。

2.2.7样品总酚酸的含量测定。由表1可知，10批小秦艽花样品中总酚酸含量为9.54～17.04 mg/g。

3结论与讨论

紫外分光光度法（比色法）是测定中药和天然药物中大类成分总含量的常见方法。张秀艳等[7]研究发现小秦艽花成分复杂多样，大类成分主要为环烯醚萜类、五环三萜类、黄酮类和酚酸类成分。该研究分别建立了紫外分光光度法测定小秦艽花中总环烯醚萜和总酚酸含量的方法，并对野外采集实验室阴干的药材样品以及购买于药材市场的10批样品进行了测定，结果发现，该研究建立的方法快捷、准确，以期为小秦艽花药材的质量评价和资源利用提供科学依据。

该试验对小秦艽花总环烯醚萜的提取条件进行了考察，对不同提取溶剂（先考察水、30%、50%、70%、100%甲醇;后考察40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%甲醇）、提取方法（超声提取和回流提取）、提取时间（20、30、40、50、60 min）和取样量（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g）等单因素进行考察，最终确定取样量为0.1 g，加60%甲醇25 mL，超声提取30 min为总环烯醚萜的最佳提取条件。

对小秦艽花总酚酸的提取条件进行了考察，对提取溶剂（先考察水、30%、50%、70%、100%甲醇;后考察80%、85%、90%、95%甲醇）、提取方法（超声提取和回流提取）、提取时间（30、60、90、120 min）、回流次数（1、2、3次）和取样量（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g）等单因素进行考察，确定0.1 g取样量，加95%甲醇25 mL，回流2 h、回流1次为总酚酸的最佳提取条件。

参考文献

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