天然橡胶生物合成相关基因表达与橡胶产量的相关性

杨署光 陈月异 李言 张世鑫 张晓飞 曾霞

摘  要  胶乳被认为是橡胶树的一种与伤害应答相关联的保护物质。割胶可以显著促进橡胶生物合成，且此促进作用与激活乳管细胞中橡胶生物合成相关基因的表达相关，但相关性大小尚不清楚。本文通过qPCR分析了正常割胶条件下，6个橡胶生物合成相关基因HbHRT2、HbSRPP、HbREF、HbHMGR1、HbHRT1、HbGAPDH在5个橡胶树魏克汉种质和5个1981IRRDB种质胶乳中的表达情况。结果显示：这6个基因在魏克汉种质中的表达水平显著高于1981IRRDB种质，分别是后者的1.05～14.62、0.97～4.26、1.46～12.56、0.83～2.99、0.43～7.54、1.92～11.31倍，平均值是后者的7.54、2.55、5.69、1.71、2.71、4.91倍。相关性分析表明，这些基因的表达与橡胶树干胶产量呈正相关，其中，HbREF和HbGAPDH的表达水平与干胶产量之间的相关性最高，有望作为橡胶树产量育种的分子指标。

关键词  巴西橡胶树;割胶;橡胶生物合成;基因表达

中图分类号  S31      文献标识码  A

在亚马逊森林，橡胶树与其他10多种橡胶属植物共存，而所有橡胶树种均为雌雄同株，并有优先异交的习性[1-2]，因此，橡胶树是一个高度杂合的物种复合体[3]，其种群/种属间存在高频的基因流动[4-9]。1876年，魏克汉（Wickham）从巴西收集了7万多粒橡胶树种子，获得了少量的种子苗。20世纪初，有20多株种子苗被成功引种到东南亚，成为该地区几乎所有橡胶树种植园的先祖。1920s以前，橡胶树主要通过种子和芽接的方式繁殖。1920s以后，人们开始了杂交育种工作[10-11]。经验表明，从杂交授粉开始到完成系列选育种过程耗时30多年[12]。由于引种驯化时间短，目前栽培的几乎所有无性系品种以及仍在选择中的基因型与亚马逊森林野生祖先相隔不到10代，这对于一个大面积种植的树种来说世代数太少[4]。人工杂交育种到目前也才进入到第四代。可见，橡胶树大规模种植和遗传改良的历史并不长。虽然绝大部分无性系起源于19世纪引种到亚洲的所谓‘魏克汉树，但由于大多数的栽培品种仍包含足够的等位基因多样性，这使得遗传改良成为可能[4， 13]。研究表明，橡胶树种群间的基因结构还没有明显的分离，不同来源种质间共享80%左右的等位基因[4]。以魏克汉种质为亲本杂交获得的F1代的产量变异系数高达50.7%～ 100.1%[14-16]。

天然橡胶是巴西橡胶树的重要次生代谢产物，来源于类异戊二烯代谢途径，涉及一系列橡胶生物合成关键酶[17]，如橡胶延伸因子（rubber elongation factor， REF）[18]、小橡胶粒子膜蛋白（small rubber particle protein， SRPP）[19]、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（3-hydro xy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase， HM G R）[20]、橡胶转移酶（Hevea brasiliensis rubber transferase， HRT）[21]等。橡胶树的产量性状是一种典型的次生产量性状，由反复合理的收获胁迫（割胶）形成[22]。割胶后流出的胶乳是乳管细胞的细胞质，是橡胶树应答伤害的相关保护物质。研究发现，细胞质中的3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， G A PDH;主要是参与糖酵解反应）基因可以响应多种胁迫反应，在植物抗逆过程中发挥重要调控作用[23]。割胶后，与胶乳再生和防卫相关的基因表达增强，同时伴随着蛋白合成效率的提高，从而使胶乳的代谢活性增加。机械伤害和割胶可以显著促进乳管的分化[24]，显著提高REF[17， 25]、SRPP[19， 25]、FPS[26]等和乳胶生物合成相关基因的表达[27]。但是，橡胶生物合成相关基因的表達与橡胶产量的相关性尚不清楚。本研究通过分析橡胶生物合成相关基因的表达与橡胶产量的相关性，旨在找到与产量相关的分子标记，这对于育种周期长的橡胶树产量育种而言具有重要的实际应用价值。可为研究橡胶树产量形成的调控机理、开发新型的产量刺激剂提供理论基础，为研发橡胶树产量早期预测技术、通过转基因育种等途径提高橡胶树产量提供备选基因。

1  材料与方法

1.1  材料

实验材料是割龄为10 a的巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）的5份魏克汉种质和5份1981IRRDB种质。其中5份魏克汉种质是经过人工选育的橡胶树品种PR107、RRIM600、热垦628、热垦525和热垦523;5份1981IRRDB种质未经人工选育，编号为RO/CM/10 44/160、MT/IT/13 29/8、RO/C/8 24/104、RO/I/103 107、RO/CM/10 44/454。这些实验树种植于中国热带农业科学院试验场。

DNaseⅠ购自天根公司。反转录试剂盒RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit购自Ferments公司。qPCR试剂SYBR? Ppermix Ex TaqTM Ⅱ（2×）（Tli RNaseH Plus）购自大连宝生物公司（TaKaRa Japan）。其他生化试剂均为进口或国产分析纯试剂。引物合成由Invitrogen公司完成。

1.2  方法

1.2.1  材料处理  每个种质随机挑选3株，在生产中正常割胶（S/2D d3：二分之一树围，阳刀，三天一刀）的第十刀，收集前10 min流出的胶乳，每个种质均取3株的等体积混合样，用于提取胶乳总RNA。

1.2.2  总RNA的提取与cDNA的合成  胶乳总RNA提取参照曾日中等[28]的方法。cDNA第一链的合成根据试剂盒的操作步骤进行：取1 μg胶乳总RNA反转录合成cDNA第一链，稀释10倍后作为qPCR分析的模板。

1.2.3  基因表达分析  （1）qPCR反应。qPCR反应体系为20 μL，其中SYBR? Ppermix Ex TaqTM Ⅱ（2×）10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL（引物浓度为10 μmol/L，反应体系中每条引物终浓度均为0.2 μmol/L）、cDNA模板1 μL、ddH2O 8.2 μL。qPCR反应在LightCycler? Capillaries（20 ?l，Roche）毛细管中完成，在Roche Diagnostics公司的Light Cycler Real Time PCR扩增仪中运行，实验操作按仪器使用说明书进行，qPCR反应程序：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环，然后进行溶解曲线分析（60～95 ℃，0.2 ℃/S），运行结束后冷却至40 ℃。每个样品做2次技术性重复，Cq标准差控制在0.2以内。利用LightCycler Software 4.05软件采集qPCR反应的Cq值。（2）qPCR引物筛选。根据

GenBank登录的基因的cDNA全长序列设计qPCR引物。以10倍梯度稀释的cDNA为摸板制备标准曲线，获得目的基因qPCR引物的扩增效率，选择扩增效率在85%以上的引物对开展实验;通过溶解曲线峰的数目判断引物的特异性，选择具有单一的溶解曲线峰的引物对开展实验;获得的qPCR产物通过测序印证。该研究所用引物见表1。（3）基因表达分析。根据“Q=2△Cq= 2min Cq-Sample Cq”计算基因的表达值（Q），以Hb18S作为内参基因，根据“E=Q目的基因/Q内参基因”分析目的基因的相对表达值（E）。样本间相对基因表达倍数[29]可直观的反映出彼此間表达差异的大小，根据“F=EA/EB”分析样本A对样本B的基因相对表达倍数（folds，F）。根据“变异系数（C·V）=标准差（s）/平均数（）×100%”分析基因表达倍数的变异系数。

1.3  数据处理

用Excel 2003软件作图，用SPSS软件的Duncan检验进行多重比较分析。用Excel TTEST（Array 1，Array 2，Tails 1，Type 1）进行成对比较分析。用SPSS软件分析基因表达和参照曾霞等[30]的方法获得的干胶产量的Pearson相关性。

2  结果与分析

2.1  qPCR引物筛选

以10倍梯度稀释的cDNA为摸板制备标准曲线，获得目的基因qPCR引物的扩增效率在89%～98%之间（图1A）;溶解曲线分析表明，各个基因的引物均获得单一的溶解曲线峰、无模板对照（NTC）无扩增产物，表明qPCR没有任何非特异性的扩增（图1B）。

2.2  橡胶树种质间橡胶生物合成相关基因的表达分析

qPCR分析表明，HbHRT2（图2A）和HbSRPP（2B）仅在1个（20%）1981IRRDB种质中达到魏克汉种质的表达水平;HbHMGR1（图2D）仅在1（20%）个魏克汉种质中低至1981IRRDB种质的表达水平;HbHRT1（图2E）仅有2个（40%）魏克汉种质显著高于1981IRRDB种质的表达水平，3个（60%）魏克汉种质和1981IRRDB种质中表达水平相当;值得注意的是，HbREF（图2C）和HbGAPDH（图2F）在所有魏克汉种质中的表达量均极显著高于1981IRRDB种质。统计分析表明，这6个基因在魏克汉种质组的表达水平均显著高于1981IRRDB种质组，其中HbHRT2、HbSRPP、HbREF和HbGAPDH差异极显著（图2H）;80%的魏克汉种质中，6个基因表达的平均值均显著高于1981IRRDB种质（图2G）。

魏克汉种质分别对1981IRRDB种质的基因表达倍数的结果表明（表2），优势表达基因是HbHRT2、HbREF和HbGAPDH，平均表达倍数分别为7.54、5.69和4.91倍，最大倍数均超过10倍。但是，同一基因在不同种质间的表达倍数有明显差异，变异系数分别为58.26%（HbHRT2）、74.00%（HbHRT1）、40.40%（HbSRPP）、69.43%（HbREF）、36.09%（HbHMGR1）、62.33%（HbGAPDH）。值得注意的是，HbGAPDH在5个魏克汉种质对1981IRRDB种质的表达倍数均

A.通过标准曲线计算出qPCR的扩增效率为89%～98%;纵坐标：Cp值，横坐标：模板浓度的对数。B.通过溶解曲线分析qPCR扩增的特异性，均获得单一的溶解曲线峰，并且无模板对照（NTC）无扩增，说明qPCR没有任何非特异性的扩增;在18S的扩增中，虽然NTC有很少的一点扩增（Cp =31.1±2.2），但Cp值远远小于样品的Cp值（9.5±0.3），因此对定量无影响;纵坐标：荧光（530 nm）强度，横坐标：温度（65～95 ℃）。

2.3  橡胶树种质间橡胶生物合成相关基因与干胶产量的相关性分析

Pearson相关性分析结果表明，HbSRPP、

HbREF和HbGAPDH基因表达与干胶产量均呈显著相关（p<0.05）;值得注意的是，HbREF和HbGAPDH基因表达与干胶产量呈极显著相关（p<0.01）（表3）。

横坐标（A～G）：从左到右（1～10）依次代表魏克汉种质PR107、RRIM600、热垦628、热垦525、热垦523以及1981IRRDB种质RO/CM/10 44/160、MT/IT/13 29/8、RO/C/8 24/104、RO/I/103 107、RO/CM/10 44/454;G. 每个种质的基因相对表达量为HbHRT2， HbSRPP， HbREF， HbHMGR1， HbHRT1和 HbGAPDH这6个基因表达值的平均数±标准差;H. 每个基因的相对表达量为5个魏克汉种质或5个1981IRRDB种质中的平均数±标准差;不同大写字母或**表示组间差异极显著（p<0.01），不同小写字母或

3  討论

割胶促进橡胶树合成天然橡胶，2次割胶之间的橡胶再生涉及到橡胶合成酶基因的诱导表达调控[27]。割胶可以显著提高REF[18， 25]、SRPP[19， 25]等橡胶合成酶基因的表达。因此，应可通过研究橡胶合成酶基因在不同干胶产量种质中的表达差异来筛选产量相关的分子标记。

一般认为变异幅度大于2倍的基因为差异表达基因[29]。魏克汉种质组胶乳中HbHRT2、HbSRPP、HbREF、HbHRT1和HbGAPDH基因的表达水平平均是1981IRRDB种质组的2倍以上，表明这5个基因是两组种质的差异表达基因;其中HbHRT2、HbREF和HbGAPDH的表达差异最大。HbREF和HbGAPDH基因表达与橡胶树种质干胶产量的Pearson相关性高，有望作为橡胶树产量育种的侯选分子标记。

一个假设在训练数据上能够获得比其他假设更好的拟合，但是在训练数据外的数据集上却不能很好地拟合数据，此时认为这个假设出现了过拟合的现象。出现这种现象的主要原因是训练数据中存在噪音或者训练数据太少[31]。需要注意的是，该研究的样本数量有限，存在过度拟合的可能性，因此，该研究结果需要扩大群体进一步印证。

尽管个别基因在个别1981IRRDB种质中已达到魏克汉种质的表达水平，但4个（80%）魏克汉种质中这6个基因的整体平均表达水平极显著高于1981IRRDB种质，1个（20%）魏克汉种质中这6个基因的整体平均表达水平显著高于4个（80%）1981IRRDB种质，表明它们在调控橡胶生物合成过程中具有协同作用。

该研究的5个魏克汉种质中，RRIM600的亲本组合为Tjirl×PB86[14-15]，热垦628的亲本组合为IAN873×PB235[14]，热垦525的亲本组合为INA873×RRIM803[15]，热垦523的亲本组合为IAN873×PB260[14];PR107为初生代无性系[16， 32]，RRIM600为次生代无性系[13， 33]，热垦628、热垦525、热垦523为四生代无性系。5个1981IRRDB种质RO/CM/10 44/160、MT/IT/13 29/8、RO/C/8 24/104、RO/I/103 107、RO/CM/10 44/454分别来自巴西的不同地区，种植名称中的字母表示来源地的代号。10份种质间具有一定的多样性，并且他们的产量都是经过长期测定的结果，因此该研究的结果具有一定的可靠性。

参考文献

Seibert R J. The uses of Hevea for food in relation to its domestication[J]. Missouri Botanical Garden Press， 1948， 35（2）： 117-121.

Baldwin J J T. Hevea： a first interpretation. A cytogenetic survey of a controversial genus， with a discussion of its implications to taxonomy and to rubber production[J]. Journal Of Heredity， 1947， 38（2）： 54-64.

Priyadarshan P M， Goncalves P S. Hevea gene pool for breeding[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2003， 50（1）： 101-114.

de Souza L M， Le Guen V， Cerqueira-Silva C B， et al. Genetic diversity strategy for the management and use of rubber genetic resources： more than 1，000 wild and cultivated accessions in a 100-genotype core collection[J]. Plos One， 2015， 10（7）： 1-20.

Lam L V， Thanh T， Chi V T， et al. Genetic diversity of hevea IRRDB81 collection assessed by RAPD markers[J]. Molecular Biotechnology， 2009， 42（3）： 292-298.

Saha T， Roy C B， Nazeer M A. Microsatellite variability and its use in the characterization of cultivated clones of Hevea brasiliensis[J]. Plant Breeding， 2005， 124： 86-92.

Souza L， Mantello C， Santos M， et al. Microsatellites from rubber tree （Hevea brasiliensis） for genetic diversity analysis and cross-amplification in six Hevea wild species[J]. Conservation Genetics Resources， 2009， 1： 75-79.

Feng S P， Li W G， Huang H S， et al. Development， characterization and cross-species/genera transferability of EST-SSR markers for rubber tree （Hevea brasiliensis）[J]. Molecular Breeding， 2009， 23： 85-97.

Mantello C C， Suzuki F I， Souza L M， et al. Microsatellite marker development for the rubber tree （Hevea brasiliensis）： characterization and cross-amplification in wild Hevea species[J]. BMC Research Notes， 2012， 5： 329.

曾  霞， 李维国， 高新生， 等. 巴西橡胶树选育种研究现状趋势及我国的研究策略[J]. 热带农业科学， 2013， 33（6）： 30-36.

Van Helten V M. Het oculeeren van Hevea. Arch voor Rubbercult Ned[M]. Ind， 1918， 2： 87.

Tan H. Strategies in rubber tree breeding[M]//Abbott A J， Atkin R K. Improving Vegetatively Propagated Crops [M]. London： Academic Press， 1987： 27-62.

毛常丽， 吴  裕， 张凤良， 等. 云南保存橡胶树魏克汉种质资源亲子系谱分析[J]. 植物遗传资源学， 2015， 16（6）： 1206-1213.

张晓飞， 黄  肖， 高新生， 等. 橡胶树胶木兼优无性系杂交利用初报[J]. 热带作物学报， 2015b， 36（11）： 1921-1925.

余文才， 宁连云， 邱彦芬， 等. 橡胶树胶木兼优品种热垦525杂交子代早期鉴定[J]. 热带农业科技， 2018， 41（4）： 6-11.

李维国. 橡胶树产量育种杂交组合早期评价及产量性状的分析[D]. 海口： 海南大学， 2013.

Koyama T， Tanaka Y. Isopentenyl diphosphate isomerase in rubber latex[J]. Phytochemistry， 1996， 43（4）： 769-772.

[18] Dennis M S， Light D R. Rubber elongation factor from Hevea brasiliensis Identification，characterization， and role in rubber biosynthesis[J]. Journal of Biological Chemistry， 1989， 264（31）： 18 608-18 617.

Collins J E. The role of small rubber particle proteins in rubber biosynthesis[D]. Reno： University of Nevada， 2009.

Chye M L， Tan C T， Chua N H. Three genes encode 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase in Hevea brasiliensis： hmgr1 and hmgr3 are differentially expressed[J]. Plant Molecular Biology， 1992， 19（3）： 473-484.

Asawatreratanakul K， Zhang Y W， Wititsuwannakul D， et al. Molecular cloning， expression and characterization of cDNA encoding cis-prenyltransferases from Hevea brasiliensis - a key factor participating in natural rubber biosynthesis[J]. European Journal of Biochemistry， 2003， 270（23）： 4671- 4680.

林位夫. 作物次生产量特性及其利用对策探讨[J]. 热带作物学报， 2012， 33（4）： 602-604.

Kappachery S， Baniekal-Hiremath G， Yu J W， et al. Effect of over-and under-expression of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase on tolerance of plants to water-deficit stress[J]. Plant Cell Tissue And Organ Culture， 2015， 121（1）： 97-107.

郝秉中， 吴继林， 云翠英. 排胶对橡胶树乳管分化的促进作用[J]. 热带作物学报， 1984， 5（2）： 19-23.

Sookmark U， Pujade-Renaud V， Chrestin H， et al. Characterization of polypeptides accumulated in the latex cytosol of rubber trees affected by the tapping panel dryness syndrome[J]. Plant And Cell Physiology， 2002， 43（11）： 1323-1333.

Adiwilaga K， Kush A. Cloning and characterization of cDNA encoding farnesyl diphosphate synthase from rubber tree （Hevea brasiliensis）[J]. Plant Molecular Biology， 1996， 30（5）： 935-946.

Deng X M， Guo D， Yang S G， et al. Jasmonate signalling in regulation of rubber biosynthesis in laticifer cells of rubber tree （Hevea brasiliensis Muell. Arg.）[J]. Journal Of Experimental Botany， 2018， 69（15）： 3559-3571.

曾日中， 段翠芳， 黎  瑜， 等. 茉莉酸刺激的橡胶树胶乳cDNA消减文库的构建及其序列分析[J]. 热带作物学报， 2003， 24（3）： 1-6.

Bénédicte C， Anthony C， Yves H， et al. Expression profiling of the whole Arabidopsis Shaggy-Like Kinase multigene family by real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction[J]. Plant Physiology， 2002， 130（2）： 577-590.

曾  霞， 胡彦师， 黄华孙， 等. 橡胶树1981IRRDB种质主要性状鉴定评价—1987年定植种质鉴定评价研究报告[J]. 热带作物学报， 2006， 27（2）： 34-38.

陳大伟， 闫  昭， 刘昊岩. SVD系列算法在评分预测中的过拟合现象[J]. 山东大学学报， 2014， 44（3）： 15-21.

张晓飞， 胡彦师， 黄华孙， 等. 橡胶树优良亲本PR107的研究与利用[J]. 热带农业科学， 2015， 35（4）： 39-44.

张晓飞， 胡彦师， 黄华孙， 等. 橡胶树优良亲本RRIM600的研究与利用[J]. 热带农业科学， 2014， 34（6）： 35-40.