青天葵独脚金内酯信号转导关键基因D14的克隆与亚细胞定位分析

李炎坤 卓一南 曾湘达 何瑞

摘  要  D14基因是独脚金内酯信号转导途径的关键基因，其编码的蛋白能够使SLs释放出活性小分子物质而发挥调节腋芽起始的功能。本研究根据其他物种的D14基因从青天葵转录组数据中筛选获得2条高度同源的片段，命名为NfD14a和NfD14b。应用RT-PCR和RACE技术，克隆获得NfD14a和NfD14b的cDNA全长序列，GenBank登录号分别为MH028026、MH028027。NfD14a基因全长1206 bp，ORF为861 bp，编码286个氨基酸;NfD14b基因全长1082 bp，ORF为813 bp，编码270个氨基酸。对NfD14的编码蛋白序列进行了生物信息学分析，结果表明：NfD14a和NfD14b均属于a/b折叠蛋白水解酶超家族成员（Abhydrolase superfamily），但系统进化分析结果表明两者同源性不高。利用一步快速克隆的方法构建了植物表达载体35S：：NfD14a-EGFP和35S：：NfD14b-EGFP，并分别获得其工程菌。瞬时表达结果表明，NfD14a和NfD14b均定位在烟草原生质体的细胞核和细胞质。本研究通过对NfD14基因全长cDNA序列的克隆与亚细胞定位分析，为青天葵独脚金内酯信号转导途径调控植物分枝生长发育机制的研究奠定基础。

关键词  青天葵;独脚金内酯;D14;RACE克隆中图分类号  S567      文献标识码  A

岭南药材青天葵来源于兰科植物毛唇芋兰[Nervilia fordii （Hance） Schltr.]的干燥叶或全草，主要分布于两广、海南、四川、云南等地区。青天葵具有清热润肺、解毒消肿的功效，主治肺痨咳血、肺热咳嗽、口疮、喉咙肿痛等[1]呼吸道疾病，代表性中成药有天龙咳喘灵胶囊、天龙茶、天龙喘咳灵等[2-3]，具有较高的经济价值。然而青天葵自身繁殖能力低，临床需求量大，过度采挖造成青天葵野生资源严重枯竭。虽然研究人员已经对青天葵展开了多方面的研究[4-6]，但对于解决青天葵药用资源短缺的问题收效甚微。

近年来，研究人员从植物的多分枝突变体中发现了一类新型植物激素——独脚金内酯（Stri golactones，SLs），具有抑制植物分枝生长、控制中胚轴伸长、促进侧根形成和诱导根毛伸长的作用[7-8]。目前已经被证实参与独脚金内酯的合成和运输途径的关键基因有D27、CCD7、CCD8、MAX1、D3、D53和D14等[9-10]。其中D14基因是独脚金内酯运输途径中的关键基因，能够与D3蛋白形成SCF蛋白复合体，与SLs结合释放出活性小分子物质CLIM（covalently linked inter mediate mole cule），从而发挥SLs的生理活性，同时促进D53被26S降解，抑制植物的分枝[11]。另外，研究人员从水稻中克隆得到了参与到独脚金内酯信号转导的3个D14基因，包括DWARF2、D88和HTD2，发现这些基因都参与控制水稻的分蘖[11];在拟南芥中，研究发现CLIM与受体AtD14的催化中心以共價键结合，进而激活SLs的信号转导，揭示了“底物-酶-活性分子-受体”的新机制[12-15]。矮牵牛中克隆得到D14的同源基因DAD2，在酵母双杂交实验中，在GR24存在的条件下，可以与PhMAX2A相互作用启动SCF介导的信号传导途径，而且其构象发生变化;同时，DAD2可以水解GR24，但水解产物不能促进蛋白间的相互作用，对植物的分枝不起调控作用，暗示DAD2在独脚金内酯通路中可能不起水解酶的作用[16]。除此之外，D14基因还参与了植物的其他应激反应。有文献报道，水稻OsD14基因在正常条件下是被抑制表达从而促进其分蘖，但是受到寒冷胁迫后，OsMADS57与OsWRKY94结合并激活OsD14的转录，促进OsD14基因的表达而抑制其分蘖[17]。

青天葵每株仅一个块茎及一片叶子，产量极低，具分枝的青天葵植株极为罕见。开展青天葵中独脚金内酯信号转导途径中D14基因的相关研究，有助于了解独脚金内酯信号转导途径在青天葵中对侧枝生长发育的影响，可为今后深入研究NfD14的蛋白结构与功能等奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  植物材料  本研究所用植物材料青天葵为广西壮族自治区中医药研究院中药资源研究所黄云峰老师采集并鉴定，确认其为兰科植物毛唇芋兰[Nervilia fordii （ Hance） Schltr.]，于广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心实验室培育。烟草NC89种子为华南植物园潘丽珠老师馈赠，采用土培直播法培育2个月后采集叶片用于亚细胞定位实验。

1.1.2  菌株与质粒  大肠杆菌（Escherichia coli）菌株E. coli Top10感受态细胞和pLB Vector均购自天根生化科技（北京）有限公司。农杆菌菌株EHA105感受态细胞购自广州市春泥生物科技有限公司。

1.2  方法

1.2.1  青天葵NfD14基因的筛选  从NCBI下载得到水稻和拟南芥的D14同源基因碱基序列，与课题组前期建立的青天葵转录组注释的Unigenes数据库进行比对，筛选得到高度同源的Unigenes-NfD14片段。

1.2.2  叶片总RNA的提取与cDNA第一链的合成  参照梁凌玲等[18]优化的RNA提取方法（改良RNAiso Plus法）提取青天葵叶片总RNA，用微量分光光度计测定其浓度和纯度，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，于-80 ℃保存备用。参照PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa）说明书合成cDNA第一链，利用18S rRNA验证cDNA的完整性。

1.2.3  青天葵NfD14基因核心片段的克隆  以Unigenes-NfD14基因为模板，用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物a-F和a-R、b-F和b-R（见表1）。以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为10 μL：2×PCR Buffer for KOD FX（TOYOBO公司）5 μL，dNTPs（2 mmol/L） 2.5 μL，上游引物和下游引物（10 μmol/L）各0.25 μL，模板cDNA 0.25 μL，KOD FX（200 μL）0.25 μL，ddH2O 1. 5 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性180 s;然后进行35个循环反应，循环反应为94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s;最后72 ℃再延伸300 s，4 ℃保存。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测，确认目的片段后，按比例扩大体积至50 μL进行PCR扩增，用通用型DNA纯化回收试劑盒（天根）回收目的片段。参照pLB零背景克隆试剂盒（天根）说明书，将目的片段连接到pLB Vector并转化Top10感受态细胞，进行菌液PCR验证和DNA测序。DNA测序由广州天一辉远基因科技有限公司完成。

1.2.4  5?与3?端序列RACE克隆  以Unige nes NfD14序列为模板，分别设计5?端和3?端特异性巢式PCR引物，5?端特异性巢式引物5?a-1F和5?a-2F、5?b-1F和5?b-2F，3?端特异性巢式引物3?a-1F和3?a-2F、3?b-1F和3?b-2F（表1）。按照Ta K aRa公司的SMARTer RACE 5?/3?Kit User Manual说明书扩增得到5?-RACE和3?-RACE的cDNA第一链。分别以5?-RACE和3?-RACE的cDNA第一链为模板，扩增D14基因的5?端和3?端序列。PCR反应体系和条件参见1.2.3节，退火温度为55 ℃。将目的片段进行回收、连接、转化和鉴定后，挑取阳性菌株送广州天一辉远基因科技有限公司进行测序。

1.2.5  NfD14基因的开放阅读框的扩增  用DNAMAN软件拼接NfD14基因的cDNA全长序列，再用SnapGene软件预测其开放阅读框（ORF），设计特异性引物aORF-F和aORF-R、bORF-F和bORF-R（表1），以cDNA为模板，扩增NfD14基因的编码区序列。PCR反应体系和条件参见1.2.3节，退火温度为60 ℃。PCR扩增产物回收、菌液PCR验证和测序参见1.2.3节。编码区序列测序结果与拼接全长序列进行比对，纠正拼接序列个别错误碱基，获得NfD14基因的编码区序列。

1.3  NfD14基因的生物信息学分析

采用ProtParam（http：//web.expasy.org/protpar am/）在线工具计算目的基因所编码蛋白的分子量、等电点、总平均疏水指数（GRAVY）、脂肪系数（AI）、稳定性系数等理化性质。用Phyre2 （http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）预测蛋白质的三级结构。采用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）对编码蛋白进行亚细胞定位预测。用SignalP 4.1 Server在线软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行信号肽预测。利用NCBI的BLASTP和Smart BLAST对氨基酸序列进行同源检索和功能域在线预测，并用DNAMAN进行多重序列比对，再用MEGA 5.10构建系统进化树。

1.4  植物表达载体的构建及亚细胞定位

根据诺唯赞ClonExpressⅡ One Step Cloning Kit说明书构建植物表达载体，以含有NfD14a和NfD14b的完整编码区序列质粒，以及由陈秀珍等[19]构建含有EGFP片段的pRI101-EGFP质粒为模板，设计特异性引物pa-F和pa-R、pb-F和pb-R、EGFP-F和EGFP-R（表1）扩增NfD14a和NfD14b的完整编码区序列，以及EGFP片段。PCR反应体系和条件参见1.2.3节，退火温度为60 ℃。然后参照试剂盒说明书，将获得的目的片段与用SalⅠ和EcoRⅠ酶切后的pRI101-AN DNA质粒（TaKaRa公司）片段连接转化后，获得35S：：NfD 14a-EGFP、35S：：NfD14b-EGFP和35S：：EGFP质粒。利用冻融法将重组质粒转入根瘤农杆菌EHA105中，用载体通用引物35S和RV（表1）进行菌液PCR验证为阳性菌株后，用注射法将其导入烟草叶片中瞬时表达[20]。提取烟草叶片原生质体后，使用LSM800型激光共聚焦显微镜（德国Zeiss）观察携带绿色荧光蛋白标记的目标蛋白的表达情况及其亚细胞定位特征。

2  结果与分析

2.1  青天葵NfD14基因的筛选

通过与水稻（Oryza sativa）和拟南芥（Arabido psis thaliana）的OsD14/AtD14比对，从青天葵的转录组数据中筛选到2条高度同源的Unigenes- NfD14，命名为NfD14a和NfD14b。

2.2  叶片总RNA的提取与cDNA第一链的合成

用改良RNAiso Plus法提取青天葵叶片总RNA，微量分光光度计检测显示L1、L2、L3和L4总RNA样品的OD260/OD280均在1.9～2.0，OD260/OD230均在1.7～1.9范围，说明RNA的纯度高，未被污染。1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，28S rRNA和18S rRNA条带明亮清晰（图1），可见所获得的青天葵叶片总RNA完整性较好，可用于RT-PCR扩增实验。以反转录后获得的cDNA为模板，18S-F和18S-R为引物进行PCR扩增，得到约500 bp的清晰明亮条带（图1），说明cDNA的质量较好，可以用于后续实验。

2.3  青天葵NfD14基因的克隆

通过设计特异性引物扩增得到752 bp的NfD14a核心片段，RACE扩增获得857 bp的5?端序列和964 bp的3?端序列（图2）。另外，获得365 bp的NfD14b核心片段，RACE扩增获得422 bp的5?端序列和1029 bp的3?端序列。将核心片段、3?端序列和5?端序列进行拼接，分别得到NfD14a和NfD14b的cDNA全长序列为1206 bp、1082 bp（图2）。采用SnapGene软件分析2条基因的全长序列，分别获得其开放阅读框（ORF）、3?非编码区（3?UTR）、5?非编码区（5?UTR）（表2）。将NfD14a和NfD14b的基因序列提交GenBank数据库，登录号分别为MH028026、MH028027。

2.4  青天葵NfD14的生物信息学分析

2.4.1  NfD14蛋白的基本理化性质  ProtParam在线软件分析结果表明，NfD14a蛋白的分子量为31.16 ku，等电点为6.19，原子总数为4397，稳定性系数为39.81，属于稳定蛋白（稳定系数<40为稳定蛋白，>40为不稳定蛋白），脂肪系数（AI）

为104.97，总平均亲水性（GRAVY）为0.181，说明NfD14a属于疏水蛋白。NfD14b蛋白的分子量大小为30.02 ku，等电点为4.94，原子总数为4226，稳定性系数为38.89，属于稳定蛋白，AI为106.78，GRAVY为0.215，表明NfD14b属于疏水蛋白。

2.4.2  NfD14蛋白的保守功能域、三级结构、亚细胞定位和信号肽预测  将NfD14a和NfD14b蛋白提交到NCBI，用BLASTP在数据库中进行蛋白保守功能域分析，结果表明，NfD14a蛋白在第29个到第286个氨基酸序列、NfD14b蛋白在第11个到第265个氨基酸之间的序列均包含水解酶超家族（Abhydrolase superfamily）的保守功能域（图3A，图3B）;再进行Smart BLAST，结果显示NfD14a和NfD14b均与水解酶相似性高。使用Phyre2在线软件预测NfD14蛋白的三级结构，结果表明，NfD14a的PDB头部为水解酶，属于A链，与dad2 s96a突变体的晶体结構相似度达91%;NfD14b的PDB头部也是水解酶，属于A链，α/β折叠蛋白质家族，与拟南芥D14蛋白的晶体结构相似度达99%（图3C，图3D）。利用WoLF PSORT在线软件对NfD14蛋白的亚细胞定位进行预测可知，NfD14a蛋白定位的分布大小依次为叶绿体>细胞核=液泡>细胞质，而NfD14b蛋白定位的分布大小依次为细胞质>细胞核>叶绿体=类囊体。根据SignalP 4.1 Server在线软件预测可知，NfD14a和NfD14b蛋白的信号肽平均值分别为0.101、0.108，均小于0.500，因此推测NfD14a和NfD14b蛋白无信号肽及切割位点，属于非分泌蛋白，在细胞质中合成后不能被转运到细胞外（图3E，图3F）。

2.4.3  NfD14蛋白的进化树分析  从NCBI上筛选出与NfD14氨基酸序列相似度较高的其他物种的D14蛋白序列，并将其与青天葵NfD14基因预测的氨基酸序列进行多重序列比对。结果显示，NfD14蛋白氨基酸序列与其他物种的D14氨基酸序列有较高的保守性（图4）。使用MEGA 5.10构建的系统进化树显示，NfD14b为单独一个分支;而NfD14a与铁皮石斛聚为一支，表明其与铁皮石斛的D14氨基酸序列同源性较高，其次与水稻和甘蔗的亲缘关系较近，说明同为单子叶植物的D14基因的亲缘性较高（图5）。但是NfD14a和NfD14b与深圳拟兰D14的同源性不高，可见青天葵与同为兰科植物的铁皮石斛的亲缘关系近，而与深圳拟兰的亲缘关系较远。

2.5  植物表达载体的构建及亚细胞定位

为了研究NfD14的功能，用一步快速克隆的方法成功将NfD14的ORF序列与EGFP共同构建到植物表达载体pRI101-AN DNA中，获得了

水稻OsD14，登录号：Q10QA5.1;菊花DgD14，登录号：AJD87462.1;拟南芥AtD14，登录号：Q9SQR3.1;大豆GmD14，登录号AQY54418.1;铁皮石斛DcD14，登录号：PKU86591.1;深圳拟兰AsD14，登录号：PKA57698.1;烟草NtD14，登录号：OIT40479.1;草原水绵SpD14，登录号：AFI78791.1;软克里藻KfD14，登录号：AFI78790.1;甘蔗ScHTD2，登录号：AJY78078.1;矮牵牛PhDAD2，登录号：AFR68698.1;豌豆PsRMS3，登录号：AMB61030.1。

35S：：NfD14a-EGFP，35S：：NfD14b-EGFP质粒。测序结果正确无误后，用冻融法转化农杆菌EHA 105，分别获得其工程菌（以转入空载35S：：EGFP的农杆菌作为对照），菌液PCR结果显示分别扩增获得2107 bp和2059 bp的片段产物，说明含有NfD14a-EGFP和NfD14a-EGFP基因片段的载体质粒成功转入到了农杆菌EHA105。将获得的工程菌培养后进行烟草叶片下表皮注射并培养4～6 d，提取烟草叶片原生质体观察蛋白的定位情况。结果显示，在瞬时表达35S：：NfD14a-EGFP，35S：： NfD14b-EGFP的原生质体的细胞核和细胞质中均观察到绿色荧光，说明NfD14定位在细胞核和细胞质中。

3  讨论

独脚金内酯（SLs）作为一种新型植物激素而成为了人们的研究热点。虽然独脚金内酯的生物合成途径、生理学功能、信号转导途径、分离纯化和结构鉴定等已逐渐被了解，但是有关SLs的生物合成和信号转导途径仍有待进一步阐明。本研究着重探讨青天葵中独脚金内酯信号转导途径中的关键基因NfD14，利用RT-PCR和RACE技术，获得NfD14a和NfD14b基因的cDNA全长序列。经生物信息学分析，获得了NfD14a和NfD14b的基本理化信息。系统进化分析发现NfD14a和NfD14b并未在进化树上聚为一支，提示这两条基因的功能上可能有差异，还需进一步研究。其中NfD14a与水稻、甘蔗的亲缘关系较近，可能具有OsD14和ScHTD2参与独脚金内酯信号转导的类似功能，后续将进行拟南芥的遗传转化实验，将对该推断进一步实验验证。另外，在线软件预测NfD14a主要定位于叶绿体而NfD14b主要定位于细胞质中，提示NfD14可能参与调控植物的光合作用[21]，NfD14a与王闵霞等[22]对水稻Dwarf 14（D14）的亚细胞定位预测结果一致，同样是定位于叶绿体中，但是亚细胞定位结果显示NfD14a和NfD14b均定位于烟草叶片原生质体的细胞核和细胞质，与水稻和拟南芥的D14基因的定位结果一致[13-14]，表明青天葵、水稻和拟南芥的D14基因细胞结构中的表达情况相似。2个NfD14基因在青天葵中的发育或应激反应中是否具有不同的作用有待进一步发现。本研究为进一步鉴定NfD14基因的功能提供依据，为青天葵中独脚金内酯信号转导途径调控植物分枝生长发育机制的研究奠定了基础。

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