不同地区橡胶树红根病菌的生物学特性及室内毒力测定

贺春萍 李锐 梁艳琼 吴伟怀 黄兴 习金根

摘  要  橡胶树红根病是我国分布最广、危害最重的橡胶树根部病害。为明确我国海南和云南地区橡胶红根病菌的生物学特性及对杀菌剂的敏感性，采用十字交叉法研究了不同培养条件对病菌菌丝生长的影响，并测定了10种不同杀菌剂对病菌的抑制作用。结果表明，病原菌在玉米+橡胶根的培养基上生长最快，对温度、pH等适应范围广，温度在13～31 ℃，pH在3～10均能生长，最适生长温度为28 ℃，多数菌株最佳pH为7～9，且能利用多种碳氮源;不同的碳源中，果糖、半乳糖、麦芽糖、葡萄糖和甘露糖较适合该菌的生长;在供试氮源中，菌丝在酪氨酸、牛肉浸膏的基础培养基上生长最快，在色氨酸和尿素的基础培养基上生长最慢;光照对病菌有抑制作用，黑暗有利于菌丝生长;菌丝的致死温度为47 ℃，10 min。不同地区的病原菌株间药剂敏感性存在一定差异，戊唑醇抑菌效果最好，其EC50为0.0312 μg/mL，其次为嘧菌酯、十三吗啉、咪鲜胺和腈菌唑，EC50分别为0.5581、0.6759、1.3763和1.5603 μg/mL。

关键词  橡胶树红根病;橡胶灵芝菌;生物学特性;室内毒力

中图分类号  S763.7      文献标识码  A

橡胶树红根病是我国分布最广、发病率最高、危害最为严重的橡胶树根部病害，其病原菌具潜伏期长[1]、寄主范围广[2]、在土壤中蔓延迅速[3]和防治困难的特点，致使干胶产量损失严重和树体死亡。据调查，橡胶树红根病发病率为10%～40%，若发病未及时处理，死亡率可达100%[4]。该病害是限制我国橡胶单产提高的重要生物因子，近年来危害有愈加严重的趋势。1931年，Corner[5]将橡胶树红根病菌鉴定为橡胶树灵芝 [Ganoderma pseudoferreum （Wakef） Over. et Stei n -

m];张运强等[6-7]、彭军等[8]研究表明我国橡胶树

红根病菌有2个种群，分别为G. philippii（与G. pseudoferreum是同物异名）和G. gibbosum。当前防治橡胶树红根病主要采用十三吗啉[9-11]灌根，该药剂虽防效不错，但价格昂贵，长期使用出现防效下降现象[11]。为寻找高效、低成本防治药剂，李四有等[12]开展了8种杀菌剂对病原菌的毒力测定，蓝志南等[13]采用百枯净和虫线清、何其光等[14]通过丙环唑与三唑酮混配药剂进行橡胶树红根病的田间防治试验，黄雅志等[15]、余卓桐等[16]等对该病害的防治措施亦开展了研究。由于橡胶树红根病菌存在不同的种和变种，明确不同地区病原菌的生物学特性及其对不同杀菌剂的敏感性，对生产上指导该病害的防控意义重大。2008年，张贺等[17]对橡胶树红根病菌生物学特性进行研究，但研究仅限于一株橡胶树红根病菌的生物学特性，而对其他省和地区的橡胶树红根病菌缺乏系统的生物学研究。除张贺的研究外亦未见其他关于该病病原菌生物学特性方面的研究报道。为此，本文对采自海南省和云南省不同地理环境的6株橡胶树红根病菌菌株进行生物学特性研究，分析比较不同来源的病原菌株间生物学特性的差异，同时测定10种杀菌剂对不同地区、不同种群的2株病原菌的抑菌能力，为有效防治该病害提供科学依据。

1  材料与方法

1.1  材料

供试病原菌：橡胶树红根病菌菌株Gp002、Gp010和Gp013分别采自云南省景洪市、河口县蚂蟥堡农场和红河州，Gp038、Gp040和Gp044分别采自海南中坤农场、中国热带农业科学院试验场和海南儋州兰洋农场，由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所分离、鉴定与保存。其中菌株Gp010为G. gibbosum 种群，其余菌株为G. philippii种群。

培养基：橡胶根汁培养基、玉米粉培养基（CMA）、CMA+橡胶根汁培养基[18]、PSA培养基、PDA培养基、PDA+酵母培养基、PDA+酵母橡胶根汁培养基、面粉培养基（FA）、FA+橡胶根汁培养基、Czapek培养基、燕麦培养基（OA）、OA+橡胶树根汁培养基，培养基配方参考贺春萍等[19]。

供试杀菌剂：在预试验基础上，确定各药剂最低抑制质量的浓度，配制6个质量浓度梯度的含药PDA培养基平板。杀菌剂种类、厂家及供试浓度见表1。

1.2  方法

1.2.1  培养基对病原菌菌丝生长的影响  将纯化的病原菌制成直径为7 mm的菌饼，分别接种于1.1的供试培养基上，置于28 ℃恒温培养箱中培养，观察菌丝生长状况。7 d后用十字交叉法测量菌落直径，每处理重复4次。

1.2.2  温度对病原菌菌丝生长的影响  将纯化的病原菌制成直径为7 mm的菌饼，接种于PDA培养基上，分别置于5、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37和40 ℃恒温培养箱中培养，观察菌丝生长情况。7 d后用十字交叉法测量菌落直径，每处理重复4次。

1.2.3  pH对病原菌菌丝生长的影响  用滅菌NaOH（1 mol/L）和HCl（1 mol/L）将PDA培养基的pH分别调至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。然后采用1.2.2节中的方法接种和测量菌落直径。每处理重复5次，连续测量7 d。计算其菌落平均生长直径。

1.2.4  光照对病原菌菌丝生长的影响  从菌落边缘取直径为7 mm菌饼接种于PDA培养基上，分别置于24 h光照（日光灯，18 W）、光暗交替

1.2.5  碳源、氮源对病原菌菌丝生长的影响  参照贺春萍等[19]的方法，测定12种碳源和13种氮源对不同地区橡胶树红根病菌菌株生长的影响。每处理重复4次。28 ℃培养，培养至7 d后用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.6  致死温度测定  取灭菌具塞玻璃试管，分别置于40、45、47、49、51、53、55 ℃恒温水浴锅中，当试管内温度达到设定温度值时，加入2 mL菌丝悬浮液水浴10 min，室温中放置未水浴的试管作对照，每处理重复4次。后取经过处理的菌丝悬浮液0.2 mL在PDA培养基上涂匀，28 ℃培养。168 h后观察有无菌落生长。详情参考贺春萍等[19]方法。

1.2.7  杀菌剂对病原菌菌丝生长的影响  参照贺春萍等[20]的方法，配置6个不同浓度梯度的供试药液，制作系列浓度的含药平板。选取在PDA平板上培养7～14 d的代表性菌株Gp010（云南）和Gp038（海南），从菌落边缘取直径7 mm的菌饼接种于含药PDA培养基上，28 ℃培养7～14 d，测量菌落直径，并计算抑制率。每处理重复5次。

1.3  数据统计

采用SAS 8.02软件进行数据分析，差异显著性采用Duncan氏新复极差法检验。

2  结果与分析

2.1  培养基对菌丝生长的影响

培养基对不同菌株生长有显著影响（表2）。供试的2株病菌在12种不同培养基上均能生长，不同菌株在不同培养基上的生长速率有所差异。菌株Gp010最适培养基为OA+橡胶树根汁和CMA+橡胶树根汁，培养7 d菌落直径分别为5.25 cm和5.15 cm;菌株Gp038最适培养基为CMA和CMA+橡胶树根汁，培养7 d菌落直径分别为4.31 cm和4.28 cm。

2.2  温度对菌丝生长的影响

在PDA平板上，供试的6株菌株在10 ℃以下和37 ℃以上条件下都停止生长，13～31 ℃温度下均能生长;除Gp010最适生长温度为31 ℃外，其余5株病原菌的最适生长温度均为28 ℃（表3）。除Gp010在34 ℃条件下还能少许生长外，其余5株供试病原菌在34 ℃时菌丝都不能生长。另外，在不同温度下各菌株生长情况略有差异，以菌株Gp010的菌落生长最快。

2.3  pH对菌丝生长的影响

不同pH条件下病菌菌丝生长速率测定结果表明，各菌株在pH 3～10的范围内均能生长;在不同pH条件下，菌株生长速率存在一定差异（表4）。菌株Gp038和Gp044的最适生长pH为9，菌株Gp013的最适生长pH为8，菌株Gp040的最适生长pH为4，菌株Gp010的最适生长pH范围最宽为7～10，菌株Gp002的最适生长pH为6～7。

2.4  光照对菌丝生长的影响

在持续光照、光暗交替和完全黑暗3种条件下病菌均能生长，且供试菌株的菌丝生长速率各不相同（表5）。所有参试的病菌菌丝在无光条件下生长速率明显比有光条件下快，完全黑暗条件最适合红根病菌菌丝的生长。

2.5  碳、氮源对菌丝生长的影响

碳源对不同菌株生长有显著影响，菌株间对不同碳源的利用差异较大（表6）。在供试的12种碳源中，菌株Gp002以半乳糖、麦芽糖、山梨糖、蔗糖、可溶性淀粉和葡萄糖为最佳碳源，菌株Gp013以半乳糖和麦芽糖为最佳碳源，菌株Gp010和Gp040以果糖为最佳碳源，菌株Gp044以甘露糖为最佳碳源，而菌株Gp038以葡萄糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、鼠李糖、蔗糖、木糖、甘油为最佳碳源。

氮源对不同菌株生长的影响显著（表7）。菌株Gp002和Gp038以酪氨酸为最佳氮源，菌株Gp013和Gp040以牛肉浸膏为最佳氮源，菌株Gp010以蛋白胨、牛肉浸膏、酪氨酸、丙氨酸、酵母浸膏、甘氨酸和胱氨酸为最佳氮源，而菌株Gp044则以牛肉浸膏、蛋白胨和酵母浸膏为最佳氨源。各供试菌株在其余几种氮源间菌丝生长存在较大差异，其中硝酸钠、氯化铵、色氨酸和尿氨酸的利用率最差。

2.6  致死温度测定

参试病菌菌丝在40 ℃、45 ℃恒温水浴10 min，菌絲仍能生长，但在≥47 ℃恒温水浴10 min后菌丝不能生长。说明参试的6株橡胶树红根病菌菌丝的致死温度为47 ℃（10 min）。

2.7  杀菌剂对菌丝生长的影响

2.7.1  杀菌剂对橡胶树红根病菌EC50值的比较分析  供试杀菌剂对来自海南和云南地区不同种群的2株橡胶树红根病菌的菌丝生长抑制作用差异较大（表8）。各药剂对病菌的毒力测定结果表明，戊唑醇、嘧菌酯、十三吗啉、咪鲜胺和腈菌唑5种药剂对病菌具有显著抑制作用，其平均EC50值均小于2 μg/mL，分别为0.0312 μg/mL、0.5581 μg/mL、0.6759 μg/mL、1.3763 μg/mL和1.5603 μg/mL;三唑酮、百菌清和异菌脲对红根病菌也有较强的抑制作用，平均EC50值分别为4.1727 μg/mL、4.2787 μg/mL和4.8868 μg/mL。抑霉唑和甲基托布津的抑制作用相对较弱，其平均EC50值分别为14.1650 μg/mL和18.9393 μg/mL。2.7.2  橡胶树红根病菌对杀菌剂的敏感性分析   由表8可知，10种药剂对2株橡胶树红根病菌的斜率值均不相同，2株红根病菌菌株的斜率范围在0.5362～8.4468，其中十三吗啉、咪鲜胺、抑霉唑和嘧菌酯的平均斜率值分别为0.7832、0.9241、0.8442和0.9578，而其余6种药剂的平均斜率值均大于1。10种供试药剂斜率值最大差异范围为1.2234～4.1016倍，表明来源不同的菌株对相同药剂的敏感性亦存在较大差异。

3  讨论

红根病是橡胶树最重要的根部病害，目前已成为阻碍橡胶产业持续发展的重要生物限制因素。研究发现我国橡胶树红根病菌有2个种群（G. philippii和G. gibbosum）[6-8]，明确橡胶树红根病菌的生物学特性以及测定不同杀菌剂对病菌的室内毒力，对生产上指导该病害的防控意义重大。

本文通过对云南、海南两省的橡胶树红根病菌生物学特性研究表明，红根病菌对pH适应范围广，pH 3～10范围内均能生长，云南地区橡胶红根病菌在pH为6～9时，菌丝生长较好，说明云南菌株对碱性环境的适应性较好;海南地区橡胶红根病菌菌株Gp038和Gp044在pH为7～9，而菌株Gp040 pH为3～5时，菌丝生长较好，海南菌株多数对碱性环境适应性较好。以上研究结果与张贺等[17]报道的病菌菌丝在pH为4～8范围内均能生长、最适生长pH为6～7有些差异，这可能与不同地区的酸碱土质有较大关系，是造成两省菌株差异的主要原因。张贺等[17]研究表明，红根病病菌菌丝的致死温度为62 ℃（10 min），而本研究表明海南、云南地区病原菌的致死温度为47 ℃（10 min），这可能与不同地区的病原菌对热的忍耐程度不同有关系。

通过温度试验发现，橡胶树红根病菌对温度的适应范围广，温度在13～31 ℃均能生长，除云南地区红根病菌菌株Gp010最适生长温度为31 ℃外，其余5个菌株最适生长温度均为28 ℃;在不同温度下各地区菌株菌落直径差异较大，其中菌株Gp010菌落生长最快，菌丝生长较均一，且菌落较圆。以上研究与张贺等[17]的报道基本一致，张贺等对橡胶树红根病菌生物学特性的研究表明，该病病原菌的最适生长温度为28 ℃，而本研究表明不同种群的红根病菌最适生长温度有差异，G. gibbosum种群菌株Gp010最适温度为31 ℃，而G. philippii种群的其余5株供试菌的最适温度为28 ℃。菌株对不同碳源的利用程度各异，果糖、半乳糖、麦芽糖、葡萄糖和甘露糖适合该菌的生长。不同氮源对菌株生长有显著影响，以牛肉浸膏、酪氨酸对菌株生长促进作用最大，而在色氨酸和尿氨酸的基础培养基上生长最慢。

目前，化学防治仍然是橡胶树根病综合防治的重要措施。杀菌剂室内毒力测定中EC50值越小、斜率越大，表明病菌对药剂的敏感性越大。本研究以10种供试药剂对不同地区和种群的2株橡胶树红根病菌菌丝体生长的EC50值和毒力回归方程斜率的分析发现，戊唑醇、嘧菌酯、十三吗啉、咪鲜胺和腈菌唑5种药剂对橡胶树红根病菌的平均EC50值在0.0312～1.5603 μg/mL之间，表明这5种药剂对橡胶树红根病菌的抑菌效果较好。其中十三吗啉和咪鲜胺的斜率值稍小，这可能与它们长期用于防治橡胶根病、白粉病和炭疽病有关。在参试的10种药剂中甲基托布津斜率最大，但其EC50值也最大，抑菌活性较小;抑霉唑和甲基托布津这两种药剂的抑菌效果相对较差。本文采用农药原药进行室内毒力测定，研究结果较客观、准确，研究结果与李四有等[12]研究结果相似，其中三唑类杀菌剂、十三吗啉、咪鲜胺等药剂对橡胶树红根病菌具较强的抑制作用。本研究筛选出的戊唑醇、嘧菌酯、咪鲜胺、腈菌唑等杀菌剂有望作为十三吗啉的替代药剂应用于橡胶树红根病的防治。

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