茶小绿叶蝉危害乌龙茶茶树品种的挥发物分析

金珊 韩李伟 叶乃兴 王蔚 黄伙水 刘伟

摘  要  为明确茶小绿叶蝉危害不同抗性茶树品种后挥发物的变化，从而为抗虫茶树品种的选育提供依据，本研究选择小绿叶蝉危害虫口密度最大和最小的乌龙茶茶树品种肉桂和铁观音为材料，以GC-MS为研究手段，进行茶树组成型和虫害诱导型挥发物的测定和分析。结果表明，邻异丙基苯甲烷、-罗勒烯、反式--罗勒烯、-法呢烯、-萜品烯和3-甲基-2-环己烯-1-酮为铁观音和肉桂的主要组成型挥发物成分。2个品种在健康茶树挥发物的成分组成和各组分的含量上都存在差异。芳樟醇只在铁观音的健康茶梢中被检测到，而十三（碳）烷、乙酸辛酯、十六烷和雪松醇只在肉桂的健康茶梢上检测到。-月桂烯、-罗勒烯、反式--罗勒烯和-法呢烯在铁观音上的含量远远大于肉桂。另一方面，茶树受小绿叶蝉危害一段时间后，铁观音和肉桂在挥发物组成和含量上产生了较大的变化。二者都释放大量的-月桂烯、-罗勒烯、反式--罗勒烯、-法呢烯和芳樟醇，在危害4 h和8 h的挥发物测定中，2个品种的这些成分较危害前的增加量从1.49倍到41.22倍。此外，茶小绿叶蝉的危害还诱导了新的挥发物的产生，包括（Z）-丁酸-3-己烯酯、癸醛、吲哚、己酸-3-己烯酯和苯乙醇。（Z）-丁酸-3-己烯酯、癸醛、吲哚、己酸-3-己烯酯、苯乙醇、-月桂烯、-罗勒烯、反式- -罗勒烯、-法呢烯和芳樟醇，这10种挥发性物质可能跟茶树的诱导抗性和铁观音的抗虫性有关。

关键词  茶树;茶小绿叶蝉;挥发物;抗性

中图分类号  S31      文献标识码  A

在漫长的协同进化中，植物发展了一套完整的防御系统来抵御植食性昆虫的侵害，包括植物先天具有的组成抗性和在遭受植食性昆虫危害后植物所产生的诱导抗性[1]。其中组成抗性是植物体内固有的，跟自身基因型有关，具有全株性，且贯穿植物一生并始终起作用，如植物自身的外部形态结构和内部组织结构以及部分代谢物质对植物性昆虫的影响。诱导抗性具有开-关效应，是一种类似于免疫反应的抗性现象，如植物在受到植食性昆虫侵害诱导所产生的一些代谢物质，这些物质对植食性昆虫及其天敌产生有害或有益的影响作用。组成抗性相对固定，而诱导抗性是一种应激反应，具有明显的时空效应[2-3]。近年来，寄主的挥发物是植物抗虫研究的热点。茶树组成型挥发物（即健康茶树挥发物）和虫害诱导型挥发物（即虫害茶树挥发物）是茶树抗虫性的重要方面。

茶小绿叶蝉Empoasca sp.是我国重要的茶树害虫，其为害严重影响到茶叶的质量和产量，利用茶树品种抗虫性来减轻茶园虫害的发生，是一条有意义的途径。蔡晓明[4]研究了茶树受小绿叶蝉取食诱导后挥发物的释放动态，认为茶树主要诱导型挥发物于小绿叶蝉取食后1 h开始释放，4 h时大量产生，取食6 h后开始大量降低，不同种类害虫危害茶树所释放的挥发物均呈现昼高夜低的特点。目前，在寄主挥发性成分研究方面，最常用的研究方法为气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer， GC-MS）、电子鼻等技术[5-6]。GC-MS是比较精确的混合物解析手段，在对混合型挥发物的分析中，首先根据各化合物组分沸点的不同，采用气相色谱将混合物各成分进行分离，分离后的各组分物质先后通过质谱，经过一定的电离方式，将分子转化为离子碎片，根据不同物质有不同的离子形态，对各成分物质进行解析。利用GC-MS解析可挥发的化合物，具有客观性、重复性好等特点[7]。

王蔚等[8]之前对福建省主要乌龙茶茶树品种上茶小绿叶蝉的虫口密度进行了长期调查，结果显示，肉桂上的茶小绿叶蝉的虫口密度最大，铁观音上的虫口密度最小;其次，不同品种的健康茶树总体挥发物特征不同，随着虫害的发生、虫口数量的增加和危害时间的延长，各品种的诱导挥发物也发生变化，这可能是茶小绿叶蝉在不同品种上虫口分布差异显著的重要原因。另外，蔡晓明[4]的研究结果表明，茶树被虫害诱导释放挥发物的量随着时间有一定规律。基于以上理论，本研究运用GC-MS技术，具体分析了肉桂和铁观音2个抗虫水平不同的茶树品种在茶小绿叶蝉不同危害时间点，挥发物成分组成和含量上的差异，为茶树品种抗虫机理提供理论支持。

1  材料与方法

1.1  材料

供试材料样品为福建省主要乌龙茶茶树品种铁观音和肉桂。每个处理剪取铁观音和肉桂10 cm长的新梢5枝，分别装入8个挥發物收集装置中的样品收集瓶。样品的处理为：铁观音对照茶梢（TGY-CK）、铁观音虫害茶梢（TGY-CH）、肉桂对照茶梢（RG-CK）和肉桂虫害茶梢，每个处理做3个重复。其中，TGY-CK和RG-CK为不接虫的健康茶树新梢，TGY-CH和RG-CH为茶梢接虫处理。6个接虫处理接入的供试昆虫分别为60头3龄茶小绿叶蝉，统一来源于应用生态研究所叶蝉饲养室。供试昆虫接入前进行2 h饥饿处理。挥发物的采集时间为4、8 h，即持续采集以上处理4 h的挥发物和以上处理8 h的挥发物，进行挥发的定性定量分析。挥发物收集装置见图1。

1.2  方法

1.2.1  茶树挥发物的收集  茶树挥发物的收集参照张篷军等[9]的方法，稍作改动，如图1所示，空气经由空气压缩机流入放有活性炭的干燥装置进行过滤，经由空气流量计A计算空气流量，在此次实验中空气流量控制在200 mL/min左右，最终流入20 L的样品收集瓶内。茶梢根部放入盛有水的锥形瓶里，正立放入收集瓶内，经不同时间、不同虫害条件处理后收集的气体挥发物，通过吸附管内的吸附剂吸附。最后经过空气流量计B，随时监控在此循环中的空气流动情况，确保吸附管内的空气流动量。挥发物收集完成后，卸下吸附管，用500 L的色谱纯二氯甲烷淋洗吸附剂，随后在样品中加入0.05 μg的乙酸壬酯（nonyl acetate）做为内标用于GC-MS的相对定量，具体参照Liu等[10]方法。需要强调的是，茶树挥发物及其虫害诱导挥发物的收集采用动态顶空吸附法，即气流进入挥发物收集缸之前先经过活性炭、分子筛及变色硅胶进行洗气，以净化空气及除去水分，然后，再挥发物收集缸的出气口处安装填充有Porapak Q吸附剂（70 mg）的吸附柱，各部分间用Teflon管进行连接。进气端和出气端的空气流速皆由玻璃转子流量计调节。

1.2.2  茶树挥发物GC-MS的测定及定性定量分析  气相色谱质谱联用仪型号为7980B-5977A GC/MS（安捷伦，美国）。柱温起始温度设定为40 ℃，以5 ℃/min升至220 ℃，保持5 min。载气为氦气，载气流速1 mL/min。质谱采用EI电离方式，轰击电压70 eV，全扫描，扫描范围为35～550，检索谱库为NIST11。

定性方法：①样品中的各个成分与相应的标准化合物在GC-MS上保留时间的吻合度;②样品组分的质谱特征离子峰与GC-MS谱库中标准化谱峰的对比;③相关茶叶香气及挥发物文献。定量方法：算出总离子流色谱图中样品各成分的离子流峰面积与内标峰面积的比值而相对定量，内标物为癸酸乙酯。

1.3  数据分析

实验数据采用SAS 6.12软件进行分析，用Duncans multiple-range test方法进行方差分析。

2  结果与分析

通过对肉桂和铁观音健康茶树和虫害诱导茶树挥发物的收集，经GC-MS的分析鉴定，共解析得到21种化学成分，包括醇类、烯类、烷烃、醛类、酯类和酮类。其总离子色谱图见图2和图3，挥发物成分的组成及其相对含量见表1。

2.1  茶树组成型挥发物的分析

从2个品种的健康茶树上共鉴定出16种挥发物成分，如表1所示。其中，铁观音有12种，主要成分包括邻异丙基苯甲烷、β-罗勒烯、反式-β-罗勒烯、α-法呢烯、γ-萜品烯和3-甲基-3-环己烯- 1-酮;肉桂鉴定出15种挥发性物质，主要成分有邻异丙基苯甲烷、β-罗勒烯、α-法呢烯和3-甲基- 3-环己烯-1-酮。2个品种的健康茶树挥发物组成和各组分在含量上都存在差异。芳樟醇只在铁观音的健康茶梢中被检测到，肉桂未检测到该物质。相反，少量的十三（碳）烷、乙酸辛酯、十六烷和雪松醇只在肉桂上检测到，铁观音上未检测到。做为共有的组成型挥发物，β-月桂烯、β-罗勒烯、反式-β-罗勒烯和α-法呢烯在铁观音上的含量远远大于肉桂，铁观音中β-月桂烯在4 h-CK时是肉桂的3倍、8 h-CK时是肉桂的5倍;铁观音挥发的β-罗勒烯在4 h-CK时和8 h-CK时分别是肉桂的3.88、9.90倍;另外，铁观音挥发的α-法呢烯在4 h-CK时高达8.45，而肉桂4 h-CK挥发物未检测到该物质，8 h-CK的铁观音挥发物中含α-

法呢烯是肉桂的14.36倍。结合二者电子鼻分析和田间虫口密度调查的结果[8]，推断铁观音和肉桂挥发物这种组成成分上的差异，导致了二者健康茶梢挥发物的总体特征截然不同，这是茶小绿叶蝉在二者上选择趋性差异明显的重要原因。

RG-CK-4h：肉桂，健康茶梢，收集挥发物4 h;RG-CK-4h：肉桂，健康茶梢，收集挥发物8 h;RG-CH-4h：肉桂，虫害茶梢，收集挥发物4 h;RG-CH-8h：肉桂，虫害茶梢，收集挥发物8 h。

2.2  茶樹虫害诱导挥发物的分析

茶树受小绿叶蝉危害一段时间后，共产生18种挥发物质，如表1所示。其中，铁观音检测到18种，肉桂检测到17种。较之危害前，二者在挥发物含量上也产生了较大的变化。受茶小绿叶蝉危害后，铁观音和肉桂都释放大量的β-月桂烯、β-罗勒烯、反式-β-罗勒烯、α-法呢烯和芳樟醇， 在危害4 h和8 h的挥发物测定中，2个品种的这些成分较危害前的增加量从1.49倍到41.22倍不等。此外，茶小绿叶蝉的危害还诱导了新的挥发物的产生，包括（Z）-丁酸-3-己烯酯、癸醛、吲哚、己酸-3-己烯酯和苯乙醇。相反，在2个品种健康茶梢的挥发物中均存在的柠檬烯、石竹烯和3-甲基-3-环己烯-1-酮，随着叶蝉的取食危害，这3种物质不再产生。另外，值得一提的是，β-月桂烯、β-罗勒烯、反式-β-罗勒烯、-法呢烯和芳樟醇在2个品种上的含量差异较大，这5种物质即是2个品种的组成型挥发物成分，也是诱导挥发物。

铁观音的健康茶梢上这5种物质含量均高于肉桂，但是，肉桂受叶蝉危害后，这5个物质释放的含量大部分高于铁观音受叶蝉危害所释放的量（虫害处理8 h时β-罗勒烯和α-法呢烯除外）。由此可推断，（Z）-丁酸-3-己烯酯、癸醛、吲哚、己酸-3-己烯酯、苯乙醇、β-月桂烯、β-罗勒烯、反式-β-罗勒烯、α-法呢烯和芳樟醇这10种挥发性物质可能跟茶树的诱导抗性和铁观音的抗虫性有关。特别是β-罗勒烯和α-法呢烯在茶树抗虫机制中所起的作用有待于进一步研究。

3  讨论

蔡晓明[4]研究发现，茶树主要诱导型挥发物于小绿叶蝉取食后1 h开始释放，4 h时大量产生，取食6 h后开始大量降低，不同种类害虫危害茶树所释放的挥发物均呈现昼高夜低的特点。因此，本研究的挥发物收集实验选择于白天清晨9点开始，持续收集4 h和8 h健康茶梢挥发物和虫害诱导挥发物进行分析。此外，本研究中肉桂虫害茶梢的挥发物共检测到17种物质，通过比较发现，该品种虫害4 h挥发物有12个组分大于虫害8 h的释放量，其中有5个组分达显著性差异、5个组分只在4 h虫害茶梢中检测到，虫害诱导4 h挥发物的释放量远远高于8 h。这与蔡晓明[4]发现的茶树挥发物的释放规律一致。相比之下，虫害诱导铁观音挥发物的释放却没有明显的规律性。虽然大量物质-罗勒烯和-法呢烯在8 h虫害茶梢上的释放量远远高于4 h，但其他大部分挥发物组分的释放量在二者之间差异不显著。这可能与2个茶树品种的抗虫强弱有关。铁观音对小绿叶蝉抗性较强，而肉桂对小绿叶蝉抗性最弱，是感虫品种。在实验处理中，叶蝉接到2个品种上，通过寄主识别后，肉桂上叶蝉可能会更早开始刺探和取食，并且对寄主的危害强度较大，因此能更快的诱导肉桂释放虫害诱导挥发物。而叶蝉接到铁观音上后，由于寄主的适合度较低，叶蝉并不会马上取食和危害，其辨识和接受过程较长，导致部分虫害诱导挥发物的释放高峰期后移。

Mei等[11]在东方美人茶特殊香气形成机制的研究中表明，小绿叶蝉危害使茶树叶片形成和释放更多的芳樟醇，这一特殊过程赋予东方美人茶独特的来自芳樟醇的单萜挥发物。本研究中，少量芳樟醇只在铁观音的健康茶梢中被检测到，而该物质在虫害4 h的铁观音和肉桂上大量产生，虫害8 h后又逐渐减少，但仍然高出虫害前铁观音的7倍多。本研究结果证实了Mei等的论点。

由于不同品种释放的挥发物的种类、浓度和比例存在差异，有些茶树品种可以吸引害虫取食，而有些品种则可以避免或减轻危害[12-13]。本文在实验中发现铁观音与肉桂有着明显的抗虫性差异，且铁观音的抗虫性要高于肉桂。在对其组成型挥发物和虫害诱导性挥发物进行对比中发现，抗虫品种铁观音虫害处理4 h和8 h都释放了远远多于健康对照的β-罗勒烯和α-法呢烯，肉桂却呈现相反的现象。王梦馨等[14]、韩善捷等[15]、穆丹[16]、王国昌[17]、蔡晓明[4]的研究结果均证实，茶树在小绿叶蝉危害后诱导释放更多的β-罗勒烯和α-法呢烯，与本文结果完全一致。刘亚丽[18]对蚜虫和粉虱为害黄瓜挥发物的测定结果也显示，被害虫危害后寄主释放出更多的罗勒烯。因此，可以推断罗勒烯和α-法呢烯在叶蝉选择寄主过程中有重要作用，α-法呢烯可能能够引诱叶蝉的选择危害。而所测得的挥发性物质具体对茶小绿叶蝉有引诱或是趋避的作用，或是具有吸引天敌的作用，这都需要进一步使用纯的样品挥发物，对茶小绿叶蝉或是植食性天敌进行嗅觉定向行为研究。因此要找到挥发物在影响茶小绿叶蝉选择不同茶树品种中的准确机理，必须得到已检测出的有可能对茶小绿叶蝉有影响的挥发物对其或是植食性天敌的嗅觉定向行为等具体研究信息。

虽然本研究还需利用生测手段进一步明确β-罗勒烯、α-法呢烯等在茶树抗虫方面的生物功能，但β-罗勒烯和α-法呢烯的相关研究已有大量报道。有研究结果表明，茶树被茉莉酸诱导可以产生新的挥发物β-罗勒烯和α-法呢烯，而且这2种成分参与邻近茶树之间的信号通讯[19]。也有研究认为，β-罗勒烯和α-法呢烯在植物抗逆中有重要的生态功能，β-罗勒烯是一种与植物防御启动密切相关的信号分子，它不仅能直接提高植物对某些病原菌及食草类昆虫的抗性，如上调一些植株中茉莉酸（jasmonic acid， JA）和乙烯（ethylene， ET）信号途径的表达水平;同样也能充当植物之间的信号传递分子，帮助受害植株周围的植株免遭伤害[20-21]。而α-法呢烯则是由茉莉酸甲酯激发植物大量释放的，并非从植物的所贮存的萜烯库中来[20， 22]。

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