蜈蚣草-玉米套作模式对玉米砷胁迫的缓解效应

赵宁宁，杜芮萍，邱丹，韦燕燕，何冰，顾明华，王学礼

广西大学农学院/广西农业环境与农产品安全重点实验室，广西 南宁 530004

近年来，中国农田土壤砷（As）污染程度日趋严重，给农产品的质量安全和人类健康带来了巨大隐患。据2014年4月全国土壤污染状况调查公报显示，中国土壤污染总超标率为 16.1%，其中 As点位超标2.7%。就As污染分布情况来看，呈现从西北到东南、从东北到西南方向逐渐升高的态势（施秋伶，2015）。已有研究表明，土壤中的 As可被作物强烈吸收，并通过食物链的生物放大作用对人体健康产生不良影响。例如，砷污染农田上种植的小麦（Triticum aestivum），67%的籽粒As含量高于《食品中污染物限量》（GB2762—2012）中规定的限值（段明宇等，2017）。贵州西部某燃煤电厂周边农田中种植的玉米（Zea mays），22.20%的籽粒样品超过《食品中污染物限量》（GB2762—2005）标准规定的As含量限值0.2 mg·kg-1（杨金秀等，2014）。广西作为中国 As采出量最多的省区，As潜在污染风险较大。广西西北部尤其刁江及金城江流域，是 As污染土壤的主要分布地区（宋波等，2017）。研究发现广西大厂矿区下游某村水田土壤、蔬菜地土壤As超标率分别为100%、85.7%（张丽娥，2015）。鉴于中国人口众多、耕地资源紧张这一基本国情，如何保证 As污染农田农产品安全及持续生产，又可同时修复 As污染的农田，是目前亟待解决的问题。

很多研究已证实农作物与超富集植物间套作不仅提高了超富集植物对重金属的吸收，还可降低农作物对重金属的吸收。如玉米与东南景天（Sedum alfredii）套作较单作显著提高东南景天地上部锌（Zn）含量 21.69%，显著降低玉米对 Zn的吸收（蒋成爱等，2009）。玉米与大叶井边草（Pteris cretica）套作显著提高大叶井边草对As、Cd、Pb的吸收，玉米茎部As浓度显著降低（Qin et al.，2012））。小麦套作伴矿景天（Sedum plumbizincicola）显著降低小麦 Cd含量，降幅达52.4%（Ju et al.，2015）。蜈蚣草（Pteris vittata）-玉米错位套作和并列套作均显著提高蜈蚣草生物量及其As累积量，降低了玉米籽粒中的As含量（Ma et al.，2017）。然而，大多研究都是分析植物吸收转运重金属的影响，对于套作模式下农作物体内重金属含量减少的生理机制的报道仍然较少。

本课题组前期试验表明，As胁迫下，限制性套作和开放性套作使玉米籽粒中 As含量分别显著降低了12.12%和24.24%，但同时均显著提高了蜈蚣草地上部As含量（邱丹等，2017）。为了明确套作模式对玉米 As胁迫的缓解效应，本研究采用土培试验，设置单作、限制性套作、开放性套作3种处理，用于研究玉米-蜈蚣草套作模式下 As胁迫对玉米根系形态的影响；采用水培试验，设置玉米单作、玉米-蜈蚣草套作2个处理，用于研究玉米-蜈蚣草套作模式下 As胁迫对玉米根系有机酸分泌及其体内抗氧化酶活性和MDA含量的影响。研究结果将为农田污染土壤的修复及作物安全生产提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试玉米品种为课题组筛选出的低积累玉米品种正大999，蜈蚣草为富集能力较强的生态型。

供试土壤来自于广西刁江流域某污染农田 0-20 cm的表层土壤，经过室温风干、磨碎、混匀、过2 mm筛，备用。土壤的基本理化性质为：pH值6.40，有机质 24.76 g·kg-1，全氮 1.49 g·kg-1，全磷1.22 g·kg-1，全钾17.13 g·kg-1，碱解氮122.0 mg·kg-1，速效磷 29.5 mg·kg-1，速效钾 116.8 mg·kg-1，总砷含量 550.5 mg·kg-1。

1.2 试验设计

在广西大学农学院农业资源与环境科学系温室大棚进行盆栽试验。试验分别设置土培试验和水培试验，其中土培试验用于研究不同种植模式对玉米生物量、根系形态的影响，水培试验用来分析不同种植模式对玉米根系有机酸分泌及其体内抗氧化酶活性和MDA含量的影响。两种试验的设计如下：

土培试验：设置单作、限制性套作、开放性套作3个处理，每个处理5次重复，共15盆。单作：两种植物根系用塑料薄膜（厚度为0.036 mm）隔离（由于塑料薄膜不容许作物根系和养分以及水分穿过，作物种间的促进作用和养分竞争作用均被消除）。限制性套作：两种植物根系采用 400目尼龙纱网隔离（根系无交叉，但水分和养分及可移动的重金属可以自由通过，即重金属、养分移动的竞争作用仍然存在，同时种间促进作用也可能发生）。开放性套作：两种植物根系无隔离（两根系完全交叉，水分和养分及可移动的重金属可自由流通，种间地下部竞争和促进作用共存）。试验盆栽所用塑料桶高35.0 cm、直径30.0 cm，装土15.0 kg。各处理氮、磷、钾施用量相同，N为240 mg·kg-1（以尿素提供），P2O5为120 mg·kg-1（以过磷酸钙提供），K2O为240 mg·kg-1（以氯化钾提供）。于2015年3月 29日将土壤和肥料混合均匀后装盆，施水至土壤田间最大持水量。平衡一周后，在套作处理的盆中种植一株蜈蚣草（因为蜈蚣草苗期生长速度较为缓慢，所以提前种植一段时间使其稳定），并于2015年5月11日将已浸泡12 h的玉米种子播入每盆相应位置。每盆播2粒种子，待长出幼苗后每盆留1株。培养期间各处理之间管理措施相同，浇水采用称重法维持土壤田间持水量在60%-70%。于成熟期（2015年8月24日）采集植物样品，分析玉米产量、根系形态。

水培试验：设置玉米单作、玉米-蜈蚣草套作2个处理，每个处理3个重复，共6盆。试验所用容器为容积1 L的塑料桶，其外围缠有黑色胶带以为植物根部生存提供黑暗环境，培养液采用1/5霍格兰营养液，pH 为 6.0（用 1.0 mol·L-1NaOH 或HCl溶液调控pH），每3天更换1次营养液。移栽经去离子水浸泡12 h并放置在28 ℃恒温箱中于黑暗状态下催芽至地上部长至 3-4 cm的玉米和经灭菌基质育苗并将根部先后用自来水、去离子水清洗干净的生长一致的蜈蚣草幼苗，用海绵将植株固定在塑料桶的黑色板上进行玉米单作和套作，其中，单作处理每盆移栽6株植物，套作处理每盆移栽玉米和蜈蚣草各6株。采用间断式充气（每1 h通气15 min），待玉米生长至三叶一心期时，加入As胁迫，即用 Na3AsO4·12H2O 配制浓度为 5 mol·L-1As(V)溶液，连续培养3 d后，将植株从水培容器中取出，先后用自来水、去离子水将其根系冲洗干净，放入盛有去离子水的 1 L黑色塑料桶中，光照下曝气收集6 h，收集塑料桶中的溶液，用于根系分泌物中低分子量有机酸的分析测定。之后，采集玉米三叶一心期时的第二片完全展开叶，先后用自来水、去离子水将其冲洗干净并用滤纸吸干水分，用于抗氧化酶活性和 MDA（Malondialdehyde）含量的测定。

1.3 样品分析测定方法

土壤基本理化性质测定参照鲍士旦（2000）的方法：土壤pH值采用1∶2.5的土水比，用酸度计（梅特勒-托利多SevevMulti型pH计）进行测定；土壤有机质采用 H2SO4-K2CrO7外加热法测定；土壤全氮采用半微量开氏法测定；全磷采用 NaOH熔融-钼锑抗比色法测定；全钾采用 NaOH熔融-火焰光度法测定；土壤速效磷采用NaHCO3-钼锑抗比色法测定；土壤速效钾采用NH4OAc-火焰光度法测定；土壤As总量采用王水消解-氢化物发生原子荧光光谱法（HG-AFS，AF-610A原子荧光光谱仪，北京瑞利仪器公司）测定。

根系形态采用根系扫描仪（Epson Expression 10000XL，日本）进行根系扫描，并用专业根系分析应用软件WinRHIZO分析根系的总长（cm）、平均直径（mm）、总表面积（cm2）及总体积（cm3）等根系指标。

根系分泌物经过柱吸附、洗脱浓缩、溶解过滤等前期处理后，用于有机酸的分析测定，具体步骤如下：将收集液依次通过已填充5 g H+型阳离子树脂（Amberlite IR-120B，Organo Co.，Japan）的阳离子交换柱（16 mm×14 cm）和已填充2 g甲酸型阴离子树脂（Dowex 1-X8，100-200目，The Dow Chemical.，USA）的阴离子交换柱（16 mm×14 cm），以去除阳离子并使有机酸吸附于阴离子树脂上。用15 mL 2 mol·L-1HCl（GR）分3次洗脱阴离子树脂，收集洗脱液于150 mL茄形浓缩瓶中，再用旋转蒸发仪（N-1000V，Eyela. Co.，Japan）将其在40 ℃水浴条件下真空旋转浓缩至蒸干。然后，用1.0 mL Milli-Q超纯水溶解浓缩物，经0.45 μm水系微孔滤膜过滤，滤液贮于-20 ℃冰箱中，待低分子量有机酸分析测定。

采用离子色谱法（ICS-5000，DIONEX，USA）进行低分子量有机酸的测定。测试条件如下：色谱柱为 Dionex IonpacTMAS11-HC（4×250 mm），流动相：A泵为超纯水，B泵为250 mmol·L-1NaOH，淋洗液流速为1.2 mL·min-1，采用梯度洗脱：0-5 min，6%-10% B，94%-90% A；5-12 min，10%-25% B，90%-75% A；12-12.1 min，25%-6%B，75%-94% A；12.1-20 min，6% B，94% A。电导检测器：ASRS 4 mm。

抗氧化酶活性的测定（张志良等，2003）：将叶片剪碎后，快速称取0.4 g植物样品，加入10倍量（m∶V）预冷的酶提取液（用50 mmol·L-1pH 7.8的磷酸缓冲液配制，内含1%的聚乙烯吡咯烷酮与5 mmol·L-1的乙二胺四乙酸）和少许石英砂，冰浴研磨，4 ℃，9000 r·min-1离心15 min，所得上清液为粗酶液，用于SOD（Superoxide Dismutase）、POD（Peroxidase）、CAT（Catalase）活性测定。其中，SOD活性采用南京建成公司试剂盒测定，将酶液与试剂按照对应顺序和比例混合后，用酶标仪在 550 nm处扫描测定吸光值，酶活性单位为U·mg-1；POD活性采用愈创木酚法测定，在 470 nm处测定 OD增加速度，酶活性单位为U·mg-1；CAT活性采用过氧化氢法测定，在240 nm处测定OD降低速度，酶活性单位为U·mg-1。

MDA含量的测定（张志良等，2003）：称取0.3 g植物样品于常温研钵中，加入10%三氯乙酸（TCA）3 mL和少许石英砂，研磨后，12000 r·min-1离心15 min，上清液用于MDA含量测定。采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定MDA，分别于450、532和600 nm处测定OD值，单位为μmol·g-1。

1.4 数据处理

试验数据的处理由Microsoft Excel 2013完成，图表由Origin 8.0完成，由SPSS 17.0统计软件进行数据统计，采用 Duncan检验法进行多重比较检验处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同种植模式对玉米产量的影响

由图 1可知，单作、限制性套作、开放性套作模式下，玉米籽粒干重分别为5.79、5.88、5.96 g。与单作相比，两种套作模式对玉米产量影响不显著。

图1 不同种植模式下玉米产量Fig. 1 Maize yield (dry mass) under different planting patterns

2.2 不同种植模式对植株As含量的影响

由表1可知，与单作相比，限制性套作和开放性套作分别使玉米茎、叶、籽粒中 As含量显著降低了31.90%、18.59%、12.12%、35.16%、21.92%、24.24%。限制性套作较单作显著提高蜈蚣草地上部As含量11.29%，开放性套作较单作分别显著提高蜈蚣草根部和地上部As含量32.43%和17.87%。

2.3 不同种植模式对植株根际土壤有效态As含量的影响

由图2可知，与单作相比，限制性套作和开放性套作分别显著降低玉米根际土壤有效态 As含量8.46%和8.32%。开放性套作较单作显著提高蜈蚣草根际土壤有效态As含量15.42%，而限制性套作影响不显著。

表1 不同种植模式下玉米、蜈蚣草各部位As含量Table 1 As concentration of each part of maize and Pteris vittata under different planting patterns mg·kg-1

图2 不同种植模式下玉米、蜈蚣草根际土壤有效态As含量Fig. 2 Concentration of available As in rhizophere soil of maize and Pteris vittata under different planting patterns

2.4 不同种植模式对玉米根系形态的影响

由表 2可知，与单作相比，限制性套作和开放性套作分别显著降低玉米根系总长度与根系总表面积26.54%、30.94%和16.25%、19.61%。开放性套作较单作显著增加玉米根系平均直径24.24%。两种套作处理均对玉米根系总体积未产生显著影响。

表2 不同种植模式下玉米的根系形态Table 2 Root morphology of maize under different planting patterns

表3 不同种植模式下玉米根系分泌的有机酸种类与浓度Table 3 The organic acids kind and concentration secreted by maize roots under different planting patterns g·kg-1

2.5 不同种植模式对玉米根系分泌有机酸的影响

由表3可知，单作、套作模式下，玉米根系分泌的有机酸均主要有3种，即草酸、乙酸、柠檬酸（其他有机酸分泌的含量低于仪器检测限，故未检测出来）。与单作相比，套作模式下玉米根系分泌的乙酸和草酸量分别显著增加844.68%和59.49%，但对柠檬酸分泌量影响不显著。

2.6 不同种植模式下玉米根系分泌有机酸与As含量的相关性

由表4可知，套作后，玉米根系乙酸和草酸与根、茎、叶、籽粒 As含量呈显著负相关，而柠檬酸与玉米各部位As含量无显著相关性。

表4 不同种植模式下玉米根系分泌有机酸与As含量的相关性分析Table 4 Correlations between the contents of organic acids in root exudates and the contents of As in maize under different planting patterns

2.7 不同种植模式对玉米抗氧化酶活性和MDA含量的影响

由图 3可知，单作和套作模式下，玉米叶片SOD、CAT和POD活性分别为2361、30.00、84.21 U·mg-1和 1931、16.60、80.70 U·mg-1，套作相比单作显著降低玉米叶片SOD活性和CAT活性18.21%和44.67%，但对POD活性影响不显著。

图3 不同种植模式对玉米叶片抗氧化酶活性的影响Fig. 3 Antioxidant enzymes activity in maize leaf under different planting patterns

图4 不同种植模式对玉米叶片MDA含量的影响Fig. 4 Concentration of MDA under different planting patterns

由图 4可知，单作和套作模式下，玉米叶片MDA 含量分别为 9.16、7.19 μmol·g-1。与单作相比，套作显著降低玉米叶片中MDA含量21.51%。

3 讨论

产量是反映植物的生长状况和土壤环境变化的重要指标之一。本研究结果表明，单作、限制性套作和开放性套作下，玉米产量未达到显著差异，说明两种套作模式对玉米的正常生长没有显著影响。根系是作物固定、运输和吸收水分与营养物质最关键的器官，也是作物新陈代谢与物质合成的重要器官之一（齐健等，2007）。在间套作模式下，植物的相互作用会影响根系的空间分布，从而影响其对重金属的吸收与积累。限制性套作和开放性套作模式下，蜈蚣草和玉米根系的相互作用显著降低了玉米根、茎、叶中的As含量和提高了蜈蚣草地上部As含量。从本研究结果可知：两种套作模式显著降低了玉米根际土壤有效态As含量，而开放性套作显著提高了蜈蚣草根际土壤有效态As含量。大量研究表明，植株体内As含量与土壤As的活性高度相关（Hua et al.，2009）。因此，玉米体内As含量降低的可能原因是根系的相互作用降低了根际土壤As的生物有效性，从而减少了玉米对As的吸收。在重金属胁迫下，植物可通过改变根系形态的分布，以适应环境胁迫（刘莹等，2003）。胡椒（Piper nigrum）-槟榔（Areca catechu）间作系统种间竞争导致两种植物总根长、总根表面积、平均根系直径与总根体积等根系形态指标均低于单作（杨建峰等，2015）。本研究中，As胁迫下，限制性套作和开放性套作相比单作显著降低了玉米根系总长和总表面积，这就减少了根系与土壤中 As的有效接触，从而降低玉米对As的吸收。此外，开放性套作显著增加玉米根系直径而限制性套作无显著影响的可能原因是开放性套作下与玉米根系交叉的蜈蚣草根系具有较强的 As吸收能力，吸收了土壤中大部分的 As，降低了玉米对As的吸收，从而缓解了As胁迫对玉米根系的影响，再者，玉米根系生长素、细胞分裂素等激素含量因As胁迫可能发生变化，使根尖细胞的分裂与伸长受阻，从而缓解胁迫危害以维持自身正常生长，玉米根系只能横向增粗（何俊瑜等，2008；王丽红等，2013），而限制性套作无此效应。

植物根系分泌的带有羧基官能团（-COOH）的有机酸、氨基酸等物质会通过改变根际环境的酸碱度（pH）或与重金属络合，降低其毒性并阻止其进入植物体内，在根际土壤重金属移动性、溶解性和生物有效性调节中起着重要作用（Ma et al.，2001；Chiang et al.，2011；Luo et al.，2014；陈秀玲等，2014）。玉米-超富集植物小花南芥间作显著降低44%玉米根部Pb含量，其分泌的草酸、柠檬酸、苹果酸和乙酸含量分别增加了167%、103%、127%和 1700%，而经相关性分析发现，间作模式下玉米根部Pb含量与根系分泌草酸、柠檬酸、苹果酸和酒石酸显著相关（王吉秀等，2016）。本研究发现，蜈蚣-玉米套作对玉米根系分泌有机酸的种类无显著影响，但可增加其根系对乙酸和草酸的分泌量。相关性分析结果表明，玉米根、茎、叶和籽粒As含量与根系分泌乙酸、草酸呈显著负相关，这可能降低了根际 pH，使 As生物有效性降低，从而减少了玉米对As的吸收。已有的研究表明，间套作体系下，两种植物根系的交叉可使一种植株的根系分泌物通过土壤扩散到另外一种植株的根际，改变其根际土壤中重金属的有效性，从而影响另一种植株对重金属的吸收（Cakmak et al.，1991；左元梅等，2004；陈佰岩等，2009）。草酸作为蜈蚣草根系分泌有机酸的主要成分，对土壤中As的释放起到了重要作用（吴佳，2011；刘雪，2017）。本研究中开放性套作模式下玉米和蜈蚣草根系相互接触，部分根系处于一个共同的根际环境，玉米根系分泌的草酸有可能扩散至蜈蚣草根际，造成蜈蚣草根际草酸含量显著增加，螯合As的能力增强（De et al.，2004），促进了蜈蚣草对As的吸收。蜈蚣草-桑树（Morus alba）间作可分别显著降低和提高桑树和蜈蚣草体内As浓度，研究发现无论单作或间作模式，蜈蚣草根系周围土壤中As的空间分布呈“山谷”形状，这暗示了蜈蚣草根区周围的As已被大量吸收（Wan et al.，2017）。蜈蚣草具有强吸收并富集As的能力，与玉米产生强烈的竞争作用，这也可能是开放性模式降低玉米中As含量而同时提高蜈蚣草中As含量的机制之一。此外，微生物活动及其群落结构也会对植物根际重金属的生物有效性带来影响（Jones et al.，2003；Li et al.，2007），对于本研究植物根际微生物的作用是否影响了As的有效性，有待进一步探究。

As胁迫下，植物细胞会积累大量的活性氧破坏膜系统，影响正常生理代谢，从而影响植物生长。丙二醛（MDA）作为植株体内膜脂类过氧化的最终产物，对细胞有毒害作用，其产生数量可反映膜系统伤害程度。研究表明植物体内的MDA含量上升会抑制植物生长，造成植株矮化和生长迟缓（汤叶涛等，2010；郭艳杰等，2011）。在一定范围的Cu2+胁迫条件下，玉米-豌豆（Pisum sativum）间作种植模式较单作可降低玉米根和叶中的MDA含量以维持玉米的正常生长（王晓维等，2014）。本试验发现在 As胁迫下，套作相比单作显著降低了玉米叶片中MDA含量，这说明套作降低了玉米体内活性氧自由基的含量，减轻了膜脂过氧化作用，从而在一定程度上缓解了细胞膜结构和功能的受损程度。抗氧化系统（SOD、POD、CAT）是植物为缓解危害，在长期进化与对环境的适应中形成的内源保护机制，可以有效清除植物体内的活性氧自由基（Srivastava et al.，2005；Schneider et al.，2017）。其中 SOD是酶促活性氧清除系统的第一道防线，其催化Mehler反应产生的超氧自由基生成H2O2和O2，而H2O2可被CAT进一步分解或被POD利用。多数研究表明，套作可通过降低植物氧化损伤和增强抗氧化酶活性而提高其对重金属的抗性（Cui et al.，2018；Tang et al.，2017；王晓维等，2014）。然而，本试验发现在 As胁迫下套作显著降低了玉米体内的SOD和CAT活性，这和徐佳佳等（2016）的研究结果一致。可能是因为套作模式下，玉米分泌的有机酸与As螯合，降低了As活性，减少了进入玉米体内的As，致使玉米体内的抗氧化酶活性低于单作。

4 结论

蜈蚣草-玉米套作降低了玉米根长和总表面积，增加了根直径；促进了玉米根系乙酸和草酸的分泌量，降低了玉米根际土壤有效态 As含量；降低了玉米体内抗氧化酶活性，缓解了 As胁迫对玉米的毒害。