亚硝酸盐型厌氧甲烷氧化过程与应用研究进展

孙巍，丁燕玲，张丽娟，夏春雨

龙岩学院生命科学学院/固体废弃物资源化利用福建省高等学校工程研究中心，福建 龙岩 364000

近年来，随着环境问题日益严重，全球变暖成为当今世界面临的主要环境问题之一，而大气中N2O、CH4等温室气体浓度增加则是引发全球变暖的主要因素。N2O是一种重要的温室气体，N2O产生的温室效应是等摩尔质量的CO2的310倍，其对全球温室效应的贡献达 5%（沈李东，2014）。甲烷所产生的温室效应亦不容小觑，虽然甲烷排放量仅占全球温室气体总排放量的14%（Knittel et al.，2009），但由于等摩尔质量的条件下CH4所引起的温室效应是CO2的20-30倍（沈李东，2014），且其总排放量更是以每年约 1%的速度飞快增长（Borrel et al.，2011），其对全球变暖的贡献达到了30%（Bock，2012）。因此，如何控制甲烷排放一直是受关注的热点。

亚硝酸盐型甲烷厌氧氧化（nitrite-dependent anaerobic methane oxidation，N-DAMO）是指以亚硝酸盐为电子受体将CH4厌氧氧化为CO2的生化反应，此过程可偶联甲烷氧化与亚硝酸盐还原反应（Raghoebarsing et al.，2006），是地球碳氮循环的新内容，N-DAMO的发现对于完善全球的碳氮循环具有重要贡献。此外，由于以有机物为电子供体的反硝化过程会释放大量的N2O（Knowles，1982），而N-DAMO反应过程中只会释放极少量的N2O到外界环境中（Ettwig et al.，2010）。因此，若能将N-DAMO应用于以有机物为电子供体的反硝化过程，则可大大降低 N2O的排放。此外，N-DAMO细菌以CH4为唯一能源，可将CH4氧化为CO2，明显降低等摩尔CH4排放所引起的温室效应，以达到减少全球温室气体排放的重要效益（Ettwig et al.，2010）。综上所述，N-DAMO过程在控制温室气体排放，缓解全球变暖方面具有重要的生态学意义。

综上所述，N-DAMO反应及其相关微生物的探究可提高对其在缓解温室效应等方面的认识。并且N-DAMO过程利用甲烷作为碳源优于传统的反硝化脱氮工艺，为污水处理的节能减排带来了新的研究方向。本文概括了N-DAMO 的发展概况及其功能微生物的生化反应机理，具体阐述了 N-DAMO分布的影响因子，及在不同生境中的 N-DAMO过程，浅析了 N-DAMO过程在污水处理中的应用，并探讨了 N-DAMO在实际应用中存在的问题及未来发展方向。

1 亚硝酸盐型甲烷厌氧氧化菌的发现与研究概况

自 1974-1976 年，Martens和 Reeburgh（1976）均在厌氧海洋沉积物中发现了硫酸盐型甲烷厌氧氧化（sulphate-dependent anaerobic methane oxidation，SAMO）过程，这一发现改变了一直认为分解甲烷只在有氧条件下的认知，之后硫酸盐型的甲烷厌氧氧化一直是研究者的关注热点。但由热力学定律可知，硝酸盐或亚硝酸盐与硫酸盐相比，前者更适合充当甲烷氧化的电子受体（Strous et al，2004）。随后，Strous et al.（2004）提出了新观点，认为自然界中或许存在另一类可利用硝酸盐或亚硝酸盐作为电子受体的甲烷厌氧氧化微生物。墨西哥学者Islas-Lima et al.（2004）证实了甲烷厌氧氧化可利用硝酸盐或亚硝酸盐作为电子供体，即确有反硝化型甲烷厌氧氧化（dependent anaerobic methane oxidation，DAMO）过程的存在。2006年，荷兰研究人员Raghoebarsing et al.（2006）富集获得能够以亚硝酸盐为电子受体的甲烷厌氧氧化微生物，并称此反应为亚硝酸盐型甲烷厌氧氧化（N-DAMO）。通过分子生物学技术鉴定发现富集体系中主要有两大类微生物：属NC10门的细菌占比较多，另一类是与 N-DAMO亲缘关系较远的甲烷氧化古菌（anaerobic methanotrophic archaea，ANME-2）。Ettwig et al.（2010）将属于NC10门的细菌命名为 Candidatus Methylomirabilis oxyfera（M. oxyfera）。

从2006年首次获得N-DAMO富集物后，研究者又陆续在德国康斯坦茨湖（Deutzmann et al.，2011）、荷兰污水处理厂（Luesken et al.，2011a；Luesken et al.，2011b；He et al.，2013）、中国水稻田（Wang et al.，2012）、西湖（朱群等，2013）、南海（Chen et al.，2014）、中国东部淡水湿地（Hu et al.，2014）、钱塘江（Shen et al.，2014a）等生态环境中发现N-DAMO微生物。因此N-DAMO过程对于生态环境和微生物学领域有着重大意义，该过程及其相关功能类群成为碳氮循环的研究热点。据统计：2004-2009年，学者们主要分析 N-DAMO的相关微生物（范秋香等，2015）；2010-2012年，研究者们则侧重于探究 N-DAMO菌的生化反应机理及其富集生长的调控因子（范秋香等，2015）；2012年至今则主要对N-DAMO功能微生物富集条件优化及实际应用进行探索。

2 N-DAMO菌生化反应机理

N-DAMO菌生长周期长，生长速度十分缓慢，是革兰氏阴性菌，细胞直径为0.2-0.5 µm，细胞长度为0.8-1.1 µm，细胞呈现特殊多边星形结构，而细胞外包被一层特殊蛋白，这层蛋白被认为是形成细胞特殊多边形结构的重要物质（Ettwig et al.，2008）（如图1所示）；属自养型细菌，对CH4的亲和力很强（Ettwig et al.，2008），CH4是该微生物的唯一能源物质，通过将CH4氧化成CO2来获取能量，再由卡尔文循环固定 CO2（Ettwig et al.，2010）。

图1 N-DAMO菌的透射电镜照片Fig. 1 Transmission electron microscopic photograph of N-DAMO bacteria

2010年，Ettwig et al.（2010）在N-DAMO菌的生化机理研究方面取得了重大发现，认为N-DAMO过程是地球上的第4种生物自产氧途径。Wu et al.（2011a）和 Ettwig et al.（2010）提出了N-DAMO菌的生化反应机制，即 M. oxyfera在N-DAMO菌的生化反应过程中可自主代谢产生O2，将产生的一部分O2用于CH4的氧化。N-DAMO反应过程可分为两部分：一在亚硝酸还原方面，M.oxyfera首先在NO2-还原酶的作用下，将NO2-还原为NO，之后受NO歧化酶作用，将产生的2分子NO转化为O2和N2，最后将生成的75%的O2用于甲烷的氧化，而余下的 25%的 O2则用于正常的呼吸产能，即2NO2-→2NO→N2+O2、O2+CH4→CH3OH- - - - →CO2（Ettwig et al.，2010；Wu et al.，2011a）。二在甲烷氧化途径方面，起初M. oxyfera受甲烷单加氧酶作用将甲烷转化为甲醛，之后甲醛受到亚甲基-四氢叶酸脱氢酶的催化生成了甲酸，最后甲酸受到甲酸脱氢酶催化，转化为CO2（Ettwig et al.，2010；Wu et al.，2011b；Wu et al.，2011a）。迄今为止，由 NO歧化反应产生 O2来解释甲烷进行氧化作用的假说已得到广泛认可，但NO歧化酶尚未被发现证实。

3 影响N-DAMO菌活性的环境因子

N-DAMO菌的活性主要受环境中甲烷、有机碳、硝酸盐（NO3-）、亚硝酸盐（NO2-）浓度，以及温度、pH和盐度等因素影响（如表1所示）。

3.1 硝酸盐和亚硝酸盐（NO3-/NO2-）

N-DAMO反应的电子受体是NO2-，而缺氧环境中的NO2-大多由NO3-还原而来（沈李东，2015）。因此，N-DAMO菌的分布与活性在一定程度上也受环境中的NO3-浓度影响。2018年，柴风光等（2018）研究NO3-和NO2-对富集产物的影响，结果表明以NO3-为电子受体可富集得到N-DAMO细菌和古菌的协同体系，两者可以长期稳定共存，而以 NO2-为电子受体所得的富集产物只有 N-DAMO古菌。薛松等（2018）以厌氧污泥、污水处理厂厌氧污泥和填埋场覆土为接种物富集 N-DAMO细菌，研究NO3--N浓度对甲烷氧化的影响，结果表明NO3--N浓度 500 mg·L-1与 200 mg·L-1相比，甲烷氧化速率提高了34.7%。赵荣等（2017）进行的富集物培养实验研究表明，当NO2-浓度为2.40 mmol·L-1左右时，反硝化速率最大，最适宜 N-DAMO细菌的生长，但当NO2-浓度大于3.42 mmol·L-1时，反硝化速率呈下降趋势。这可能是由于高浓度的NO2-会对N-DAMO细菌产生毒性，从而抑制N-DAMO反应。

3.2 甲烷

CH4不仅是 N-DAMO反应的电子供体，还是N-DAMO功能微生物的唯一能源物质（Ettwig et al.，2010；Chan et al.，2005）。因此，环境中存在的CH4将直接影响着N-DAMO菌的活性。但CH4在水中溶解度很低，其溶解度受CH4分压影响，若能增大CH4分压，则可提高CH4溶解度，进而增大N-DAMO反应速率。赵荣等（2017）以N-DAMO富集培养物为研究对象，探讨了 CH4分压对N-DAMO过程反硝化速率的影响，结果表明，当CH4分压在0-98 kPa范围内，N-DAMO反硝化速率随着CH4分压的增大而增大；而CH4分压从0 kPa增大到49 kPa时，反硝化速率增长较快；CH4分压从49 kPa增大到98 kPa时，反硝化速率增长减缓，表明当 CH4分压为 49 kPa时已可基本满足N-DAMO菌对CH4的需求量。

3.3 温度、pH

温度与pH都是重要的环境参数，是微生物生长与生理代谢的重要影响因子。何崭飞（2016）研究表明，N-DAMO细菌为中温微生物，最适温度为35 ℃左右。Hu et al.（2010）研究表明，当温度达到45 ℃时，虽然N-DAMO细菌仍有一定活性，但不能成功富集获得培养物，这也许是由于N-DAMO细菌中与代谢相关的某些酶在高温下失活，使得细胞失活死亡或失去繁殖能力。对于 pH，已有研究表明，N-DAMO细菌的富集培养液pH值在6.0-8.0之间（Cai et al.，2015），但这一范围较大，而找出一个最适 pH则利于 N-DAMO反应速率的提高。据报道N-DAMO细菌的最适pH值为7.6左右（赵荣等，2017；Chan et al.，2005）。

3.4 盐度

除了淡水生态系统存在N-DAMO（Deutzmann et al.，2011；Kojima et al.，2012；Shen et al.，2015；Zhu et al.，2015），一些含盐生境中也存在N-DAMO，如盐湖（Yang et al.，2012）、河口（Shen et al.，2014b）和海洋沉积物（Shen et al.，2016）。但高盐对 N-DAMO细菌具有明显的抑制作用，这可能是由高渗透压引起的（Jin et al.，2012）。此外，由于盐析作用，高盐也会直接损害细胞周质空间内的代谢酶（Zhao et al.，2013）。因此，盐度对N-DAMO具有重要影响。何崭飞等（2016）以淡水环境富集培养 N-DAMO细菌为研究对象，首次证明了 N-DAMO细菌能够适应一定含量盐度（如NaCl 20 g·L-1），但高盐能够强烈抑制N-DAMO活性并降低N-DAMO细菌的丰度，这表明N-DAMO细菌在含盐生境中也有着重要的生态作用，具有处理含盐废水的潜能。

4 N-DAMO菌在不同自然生境中的分布特点

N-DAMO菌在多种自然生境中广泛分布，如海洋、淡水及湿地生态系统，其主要分布区域如表 2所示。

4.1 海洋生态系统中N-DAMO分布特点

海洋面积占全球的71%，是大气甲烷的自然源之一，据报道，海洋每年的甲烷产生量高达85-300Tg，约占全球甲烷总产量的30%，但海洋的甲烷排放量却很低（Reeburgh，2007）。Reeburgh（1976）认为 90%以上甲烷气体在进入大气圈之前己被氧化消耗掉了，之后发现海洋生态系统存在SAMO细菌可氧化甲烷，证实了这一猜想。然而由于日益频繁的人类活动，海洋生境中不断被大量无机氮素污染物侵入，海湾和河口等近海区域尤为严重，NO3-/NO2-作为电子受体形成另一种区别于以硫酸盐为电子受体的甲烷厌氧氧化，从而受到了国际学术界的广泛关注（沈李东，2015）。近几年已有学者研究表明，在河口（Shen et al.，2014b）和海洋沉积物中（Shen et al.，2016；Chen et al.，2014）也有N-DAMO细菌存在，但N-DAMO主要存在于近海生境中，而大洋环境中是否存在 N-DAMO还有待考究。目前，人们对于海洋生境中的N-DAMO过程的研究相对匮乏，但由于近海区域外源无机氮的汇入不断增加，N-DAMO反应对于近海区域中甲烷氧化的重要性也将日益增加（沈李东，2015）。因而海洋生境中的 N-DAMO过程将是未来的研究重点之一。

表1 影响N-DAMO菌活性的环境因子Table 1 Environmental factors affecting the activity of N-DAMO bacteria

表2 不同生境中的N-DAMO菌的分布区域Table 2 Distribution areas of N-DAMO bacteria in different habitats

4.2 淡水生态系统中N-DAMO分布特点

CH4和NO2-/NO3-共存及厌氧环境是N-DAMO反应的前提条件（Thauer et al.，2006）。由于长期淹水情况导致淡水沉积物具有好氧/厌氧界面，同时淡水沉积物内含有丰富的有机物质（沈李东，2015），且淡水湖泊比海洋系统NO3--N含量更高，而海洋的甲烷产生效率仅为淡水湖泊的1/1000，因此淡水生境是N-DAMO发生的理想场所（Tang et al.，2016）。2011 年，Deutzmann et al.（2011）在德国的康坦茨湖（Lake Constance）沉积物中检测到了含有pmoA功能基因的N-DAMO菌。随后，湖泊生态系统的 N-DAMO过程成为研究热点，2012年 Kojima et al.（2012）在日本琵琶湖检测到N-DAMO细菌；2015年Liu et al.（2015）在云南高原系列湖泊中也发现了携带功能基因 pmoA的N-DAMO菌的存在；2017年Weber et al.（2017）在Danish湖和Orn湖中发现，随着湖泊深度的增加，湖泊有氧层以下的甲烷消耗强度增强，表明深层厌氧环境更适合N-DAMO菌发挥作用。此外， Shen et al.（2014a）在钱塘江沉积物中发现含有group A基因型的N-DAMO菌的分布，表明了N-DAMO功能微生物也可存在于河流沉积物中，开拓了N-DAMO菌存在于不同于淡水系统的新认知。2017年，张亚迪等（2018）对浑河底泥研究发现了N-DAMO菌的存在，并分析了其菌群多样性、分布特征及与环境因子的关系，结果表明 N-DAMO菌丰度呈现中游＞上游＞下游的分布特征，且底泥中DOC浓度、底泥电导率、水体中TOC含量和水体中亚硝酸氮浓度是影响M. oxyfera群落多样性的主要环境因子。由此可见，N-DAMO菌在湖泊及河流沉积物中均有分布，这表明 N-DAMO过程对于控制湖泊、河流等淡水生态系统的甲烷排放具有潜在的重要作用。

4.3 湿地生态系统N-DAMO分布特点

湿地被誉为“地球之肾”、“物种储藏库”等，其具有多种生态功能，蕴藏着丰富的自然资源，在保护生态环境及维持生物多样性等方面具有重要作用（孟伟庆等，2011）。湿地土壤为厌氧环境，其微生物以厌氧细菌为主，使得各种动植物残体分解缓慢或不易分解，进而形成了有机物生成远大于分解的情况，从而使土壤中积累了大量有机物（田应兵等，2002），而大量有机物的积累使得湿地成为全球最大的温室气体甲烷的天然排放源之一。据相关统计，湿地每年向大气排放甲烷 1×108-2.31×108t（翟俊等，2017）。湿地系统中的甲烷消耗主要为甲烷好氧氧化，约可消耗湿地土壤中的50%的甲烷（Bodelier，2011）。但已有研究表明N-DAMO也存在于湿地系统厌氧区域，且对湿地甲烷的消耗起着重要的作用（沈李东，2015）。

2012年，Wang et al.（2012）研究发现N-DAMO菌广泛分布于不同深度的水稻田土壤中。随后，Zhou et al.（2014）发现N-DAMO菌主要分布于水稻田深层土壤和地下水的交错带，归因于交错带的厌氧条件以及含量丰富的有机质。此外，Zhu et al.（2015）后续发现中国境内13种不同类型的典型湿地及一些极端环境的湿地中皆存在N-DAMO菌。2015年，Segarra et al.（2015）在淡水湿地研究中发现N-DAMO菌，且N-DAMO过程可氧化减少湿地50%以上的CH4排放。可见，淡水湿地作为全球最大的温室气体甲烷的天然排放源之一，N-DAMO广泛存在于其中，这表明N-DAMO对于湿地甲烷的消减和有效控制以及氮去除具有重要作用（翟俊等，2017）。因此，湿地系统中的N-DAMO反应的发生过程与关键环境影响因素仍是未来研究的热点问题。

5 N-DAMO的应用研究

传统污水处理的硝化与反硝化脱氮工艺不但耗能，且存在C/N比低的问题以致于常需外加碳源，但是常用的液态碳源运输不便，需耗费额外的物力财力（范秋香等，2015）。而 N-DAMO可利用甲烷推动亚硝酸盐的还原，污水处理厌氧过程中的最终产物为甲烷，N-DAMO便可将甲烷原位利用，同时原位产生的甲烷无需纯化可直接用于脱氮（楼菊青等，2018）。除此之外，N-DAMO过程还具有其他优势，一方面厌氧条件下可节约曝气所需的能源，具有一定的节能环保优势；另一方面可以与其他厌氧生物处理过程耦合（如Anammox等），可达到多种污染物同步去除的效果（王劲松等，2017），大大提高废水除污效率。因此，与传统脱氮工艺相比，N-DAMO具有可节约大量物质能源、减少经济成本和提高脱氮效率等优点，应用价值与前景广阔。

近年来，人们开始关注Anammox与N-DAMO的共存体系，即DAMO古菌可将Anammox细菌代谢产生的NO3--N转化为NO2--N，之后N-DAMO细菌继续完成接下来的反硝化过程，将NO2--N转化生成O2和N2（王劲松等，2017）。2015年Hu et al.（2015）成功获得了DAMO与Anommox共存的富集体系，并介绍了两者共同代谢的过程，即DAMO细菌和 Anammox菌两者的电子受体都是NO2-，因而两者呈竞争关系；Anammox菌的代谢中可产生NO3-，而NO3-可作为DAMO古菌的电子受体，因而两者呈协同关系，这说明富集体系中DAMO古菌、N-DAMO细菌和Anammox细菌可同时共存。2017年，Xie et al.（2017）采用膜生物反应器，利用DAMO与Anammox集成工艺实现了稳定高效的生物脱氮处理，能够同步去除NO2--N与NH4+-N，其去除速率分别达 560 mg·L-1·d-1和 470 mg·L-1·d-1，稳定期水力停留时间减少为1 d，总氮去除速率达1 kg·L-1·d-1，明显优于其他传统生物脱氮工艺。

6 存在的问题及展望

N-DAMO作为重要的“甲烷汇”，对于全球温室气体甲烷的减排及淡水、湿地、海洋等不同生境中无机氮素的循环具有重要意义，同时 N-DAMO反应过程的应用也成为了污水生物处理技术的新纪元，因此我们应当不断探究并重视 N-DAMO反应过程，尽量让其发挥出最大效益。近几年来，N-DAMO受到广泛关注，但对于N-DAMO过程的研究还有很多有待解决的问题，主要表现在：

（1）N-DAMO功能微生物M. oxyfera尚未得到纯培养，N-DAMO功能微生物的作用机制方面，尚有问题等待解决，如NO歧化酶这一关键因子尚未被检测到。

（2）N-DAMO自然生境研究方面，N-DAMO对于近海区域的甲烷氧化及无机氮素的循环有着重要意义，但海洋生境中 N-DAMO过程的报道还相对较少，其对近海区域碳氮循环贡献及其作用机制仍需要深入研究。此外，还应开展不同生境中N-DAMO菌活性的高精度原位测量，对所得数据进行统计与对比，以便了解不同生境中 N-DAMO菌的多样性分布及其在不同生境中对于碳氮循环所做出的贡献，为自然生态系统的碳氮循环研究提供理论依据。

（3）N-DAMO应用研究方面，N-DAMO功能微生物富集培养缓慢，富集培养物活性低，这成为限制该过程应用的最大阻碍。可通过调节富集反应运行参数，如 0.3 MPa静压条件下可有效促进N-DAMO反应的启动（王一囡等，2018）或是选取适宜的富集种泥等方法来提高 N-DAMO反应启动效率。

总之，N-DAMO可将亚硝酸还原与甲烷氧化偶联，无论在自然生态环境地球化学循环过程中，还是污水处理实际应用中，都具有显著的经济、环境和社会效益。因此，N-DAMO的相关研究仍是未来碳氮循环的研究热点，应加强探索和推进其相关工艺在实际污水处理中的应用研究。