利用芯片毛细管电泳检测技术鉴定玉米种子纯度的研究

于 滔 曹士亮 张建国 扈光辉 王成波 曹靖生 刘宝民

（1 黑龙江省农业科学院博士后科研工作站，哈尔滨 150086；2黑龙江省农业科学院玉米研究所，哈尔滨150086；3农业部东北北部玉米生物学与遗传育种重点实验室，哈尔滨150086）

玉米（Zea mays L．）是我国第一大粮食作物，2016年总产量高达2．2亿t。近年来，随着我国种业市场的快速发展，玉米种子作为我国种业的主导产品，其杂交种质量的好坏直接影响玉米大田生产、新品种市场规模、种子企业及农民的经济效益[1]，玉米种子纯度鉴定也已经成为种子质量检测的核心指标。因此，加强玉米种子纯度鉴定的标准化对于保证种子质量、保护农民利益、维护育种家权益等具有非常重要的现实意义[2]。目前，玉米种子纯度鉴定已由传统的田间小区种植鉴定技术发展到分子标记鉴定技术[3]，其中，SSR检测技术因具有操作简单、重复性好、多态性高和技术成熟等优点，被广泛应用于玉米种子纯度鉴定[4]。芯片毛细管电泳是在芯片上进行的毛细管电泳，通过以高压直流电场为驱动力，使待测样品在经过玻璃、石英或各种聚合物材料制成的微米级通道时进行高效分离及检测，与传统毛细管电泳相比，芯片毛细管电泳具备耗时短、通量高、系统体积小且易实现不同操作单元的集成等优点[5]。本研究将SSR检测技术与芯片毛细管电泳相结合，应用于具有代表性的玉米品种先玉335和郑单958的纯度鉴定，为我国今后的玉米种子质量鉴定和种业市场监管提供方案支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料 供试材料共6份，为杂交种先玉335及其亲本自交系PH6WC、PH4CV和郑单958及其亲本自交系郑58和昌7-2，研究所用玉米种子由黑龙江省农业科学院玉米研究所保存且均为随机抽样所得。

1.2 供试材料基因组DNA提取 参考植物基因组DNA提取试剂盒（天根DP305）说明书分别提取供试材料叶片DNA，应用1%琼脂糖凝胶电泳及超微量分光光度计（IMPLEN NanoPhotometer P-class）检测玉米叶片DNA质量及浓度。

1.3 SSR引物筛选 选择农业行业标准NYT1432-2007玉米品种鉴定DNA指纹方法中20对基本核心引物其中的10对引物用于区分杂交种的父母本，引物由上海生工生物工程有限公司合成，具体信息见表1。PCR反应体系为20μL，包括DNA模板（50ng/μL）4．0μL，2×Mix 10．0μL，Left primer（10μmol/L）0．2μL，Right primer（10μmol/L）0．2μL，ddH2O 5．6μL。PCR 反应程序为，94℃预变性 5min，94℃变性 40s，60℃退火 35s，72℃延伸 45s，共进行35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物经5%琼脂糖凝胶电泳检测筛选亲本间存在多态性SSR引物，染色采用EB替代物GelRed。

1.4 玉米种子纯度鉴定 选用亲本间多态性SSR引物分别对杂交种及其父本、母本进行PCR扩增，按照LabChip GX Touch DNA 1K芯片说明书对PCR产物进行芯片毛细管电泳，使用LabChip GX Touch分析软件对获取的数据进行分析，并计算玉米种子纯度=杂交种子数/检测种子总量×100%。

表1 10对引物信息

2 结果与分析

2.1 供试材料DNA的质量检测 应用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的先玉335、郑单958、PH6WC、PH4CV、郑58和昌7-2叶片DNA质量，结果如图1所示，DNA条带清晰无拖尾，说明所提取的DNA无降解，质量较高。采用超微量分光光度计测量玉米叶片DNA纯度，结果显示所提DNA样品 OD260/OD280比值均在 1．9～2．0 之间，说明本研究所制备的DNA纯度符合试验要求，可以用于后续研究。

2.2 SSR引物筛选 选择国准NYT1432-2007基本核心引物中的10对SSR引物分别对PH6WC、PH4CV、郑58、昌7-2 4份玉米自交系材料进行PCR扩增筛选亲本间多态性引物，SSR引物筛选原则为该引物在父母本中的扩增产物大小差异明显，且电泳条带尽量单一、清晰。5%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，结果见图2、图3，根据引物筛选原则，选出适用于检测杂交种先玉335的SSR引物为umc2105、bnlg2291，适用于检测杂交种郑单958的SSR引物为bnlg2291、bnlg161，鉴于bnlg2291引物在2组供试材料中均有较好的多态性，最终选择bnlg2291引物用于后续研究。

图1 玉米基因组DNA电泳检测结果

图2 PH6WC、PH4CV SSR引物筛选结果

图3 郑58、昌7-2 SSR引物筛选结果

2.3 供试材料的纯度鉴定结果 选用SSR引物bnlg2291分别扩增6份供试材料，其中杂交种先玉335和郑单958各单独提取94份叶片DNA用于PCR扩增，对PCR产物进行芯片毛细管电泳，并对获取的数据进行分析，若所获得的峰图为双峰且均与bnlg2291引物在其父母本中筛选的峰值一致，则认定为杂交种；若所获得的峰图为双峰且只有1个峰值与bnlg2291引物在父母本中的峰值一致，则认定为异交种；若所获得的峰图为双峰但双峰均与bnlg2291引物在父母本中的峰值不一致，则认定为杂株；若所获得的峰图为单峰且峰值与bnlg2291引物在父母本中的1个峰值一致，则认定为自交种。部分鉴定结果如图4、图5，玉米杂交种先玉335的纯度为（94-2）/94×100%=97．87%，玉米杂交种郑单958 的纯度为（94-1）/94×100%=98．94%。

图4 先玉335及其亲本自交系芯片毛细管电泳纯度鉴定部分结果

图5 郑单958及其亲本自交系芯片毛细管电泳纯度鉴定部分结果

3 结论与讨论

SSR分子标记基序一般为1～6bp[6]，玉米基因组中含有大量的SSR多态性标记，利用SSR分子标记鉴定玉米种子纯度，易于区分杂交种、自交种、异交种和杂株。但由于不同玉米品种间的纯度鉴定引物存在差异，所以玉米种子纯度鉴定前首先要筛选在杂交种双亲间存在多态性的SSR引物，通常选择1对引物或2对以上引物组合[7-8]。在本研究中，采用5%琼脂糖凝胶电泳检测SSR引物筛选结果，该方法分辨率虽然较聚丙烯酰胺凝胶电泳稍低，但能够清楚区分差异大小20bp左右的片段，且操作简单，大大降低试验成本及耗时，同时应用无毒的EB替代物对环境及操作人员无危害。

芯片毛细管电泳原理基于微流体技术，分辨率可以达到1bp。与传统毛细管电泳相比，芯片毛细管电泳所需样品量低于1μL检测灵敏度能够达到5pg/μL，样品分析时间可短至42s，通量提高70倍，而且分离检测过程全部由仪器自动来完成，无人工介入，无交叉污染。与荧光标记毛细管电泳相比，芯片毛细管电泳引物不需要荧光标记，且可用的引物范围较广，适用于绝大多数SSR引物，因此试验成本更经济。与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，芯片毛细管电泳根据峰值获得的数值化数据更精确，后期数据分析更简便，操作过程简单，且通量高，全程无毒无害。

本研究选用玉米杂交种先玉335、郑单958及其亲本自交系PH6WC、PH4CV、郑58和昌7-2作为试验材料，采用SSR检测技术结合芯片毛细管电泳检测技术，筛选出适用于鉴定先玉335和郑单958种子纯度的引物3对，应用bnlg2291引物鉴定先玉335和郑单958的纯度分别为97．87%及98．94%。研究结果建立一套简单、经济、高效、安全的玉米种子纯度鉴定方法，为完善玉米种子纯度快速鉴定方法提供参考。