猪化脓隐秘杆菌的分离及鉴定

刘 杰，刘守川，赵坤坤，李英英，刘维康

(洛阳中科基因检测诊断中心有限公司,河南 洛阳 471000)

2018年1月河南某猪场发生一起以关节肿胀、肺脏脓肿和胸腔积液为主要特征的疾病，临床诊断疑似为副猪嗜血杆菌，无菌取胸腔积液和肺脏送至实验室，进行实验室鉴定，分离到一株革兰氏阳性杆菌，经生化、16S rRNA鉴定并结合临床症状确定为由化脓隐秘杆菌引起的细菌疾病。

1 材料与方法

1.1 组织

无菌采取发病仔猪的肺脏和胸腔积液。

1.2 主要培养基及试剂

哥伦比亚血琼脂基础培养基、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基；无支原体新生牛血清；革兰氏染 色 试 剂；DNA Taq酶、dNTPs、DNAmarker等；细菌微量生化管及药敏纸片。

1.3 方法

1.3.1 培养基制备

按照配方称取足量哥伦比亚血琼脂基础培养基，加相应的纯化水配制100 mL培养基，121 ℃，灭菌15 min，灭菌结束后待培养基温度降至50 ℃左右，加入5 mL的绵羊血，摇匀，倒平皿。

按照配方称取足量TSA，加相应的纯化水配制100 mL培养基，121 ℃，灭菌15 min，灭菌结束后待培养基温度降至50℃左右，加入5 mL无支原体新生牛血清和100μL 1%NAD，摇匀，倒平皿。

1.3.2 细菌分离

无菌取肺脏病变组织和胸腔积液接于血培养基和TSA+血清+NAD培养基上，37 ℃，厌氧培养48 h，观察菌落形态，挑取单个疑似菌落进行革兰氏染色镜检。

1.3.3 生化鉴定

挑取疑似单个菌落接于微量生化管，进行相应的生化鉴定。

1.3.4 16SrDNA鉴定

挑取单个菌落进行16SrDNA测序分析，引物为实验 室 常 用 引 物 :16S-F1500：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’,16S-R1500：5’-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT，扩增出的目的片段大小约为1 500 bp，该引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

PCR采用50μL反应体系，即10×PCR Buffer5.0μL、dNTP4.0μL、DNA Taq酶1.0μL，16S-F1500/16S-R1500引物各2.0μL，DNA模板4.0μL，ddH2O 32.0μL。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min，94 ℃ 60 s，56℃ 30 s，72℃ 90 s，共30个循环；72 ℃10 min。取部分PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，剩余产物送北京英潍捷基公司测序，根据测序结果进行分析。

1.3.5 药敏试验

挑取疑似单个菌落接种于10 mLTSB血清培养基，置于37℃恒温摇床中，培养5～6 h，取100μL均匀涂布于MH培养基上。用纸片琼脂扩散法（K-B法）[1]，按使用说明书将药敏片均匀放置在其上，37 ℃培养16～18 h后，记录各药敏纸片的抑菌圈直径大小，根据说明书敏感和耐药性的最小抑菌圈直径判定菌株的药敏性。

2 结果

2.1 细菌分离结果

样品经分离厌氧培养后观察，血平板和TSA+血清+NAD培养基上为两种菌落，优势菌落为一种表面光滑的小菌落，该菌落在血平皿上为β溶血，革兰氏染色镜检为革兰氏阳性小杆菌，见图1。

2.2 生化鉴定结果

从表1不难看出，分离到的菌株发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖，不发酵甘露醇、山梨醇，硝酸盐、接触酶和吲哚试验阴性，与化脓隐秘杆菌生化特性一致。

2.3 16S rDNA鉴定

图1 革兰氏染色镜检（1000×）

表1 生化鉴定结果

利用16S rDNA 检测引物扩增出大小为1.5 kb左右的目的片段，如图2。对测序结果用DNASTAR软件处理，并与MCBI中已发表的16S rRNA基因序列进行同源性比较，选取同源性最高菌株的16S rRNA基因序列，采用DNASTAR-MEGALIGN软件进行多重序列比对分析，并系统进化树，如图3。从表2可以看出，目的菌与Trueperella pyogenes strain ATCC 19411同源性为99.7%，证明该菌为化脓隐秘杆菌。

2.4 药敏试验结果

分离到的菌对头孢噻呋、杆菌肽、卡那霉素、庆大霉素、阿米卡星、恩诺沙星高度敏感，对甲氧苄啶、甲砜霉素、盐酸克林霉素和盐酸林可霉素耐药，如表3。

3 讨论

图2 细菌16S扩增结果

图3 16S rRNA 基因全序列系统发育树图

表3 药敏试验结果

化脓隐秘杆菌属于隐秘杆菌属，是猪、牛、羊和其他动物黏膜上一种条件致病菌[2]，而且对人类的也有一定的致病性[3]，该菌为原发性病原体，能够在家畜间广泛传播，导致多种化脓性感染，主要引起化脓性肺炎、关节炎而且严重时可导致动物因败血症死亡[4]。部分症状与副猪嗜血杆菌症状相似,但其主要引起肝、肺化脓性结节，脾出血性肿大，在实际诊断过程中需要通过实验室诊断进一步确定。

化脓隐秘杆菌引起的疾病在牛羊养殖中较为常见，在养猪过程中较为少见，近年来有多篇报道在河北、湖北、湖南等省份发现由该菌引起的以发生肝、肺化脓性结节为主要特征的病例。

化脓隐秘杆菌主要包括4种毒力因子，即溶血素、胶原结合蛋白、神经氨酸酶及菌毛合成蛋白。化脓隐秘杆菌的致病力主要是通过这4种毒力因子体现，通过对这4种毒力因子的研究发现化脓隐秘杆菌的主要致病机理是通过神经氨酸酶提高病原菌的黏附力及致病力，并降解抗体，降低宿主免疫防御力从而使宿主发病，另外溶血素能够溶解红细胞及免疫细胞，也能够影响宿主的免疫力。在实际临床诊断中通过对这4种毒力基因的研究可对其进化过程进行大致推断[5-7]。

本次药敏试验敏感药主要有头孢噻呋、杆菌肽、卡那霉素、庆大霉素、阿米卡星、恩诺沙星高度敏感。鉴于此次化脓隐秘杆菌主要引起的临床症状主要为关节炎和肺脏化脓性结节，推荐使用穿透力较强的头孢噻呋和恩诺沙星，治疗效果较为明显。